本发明专利技术公开了一种转化药用野生稻cDNA文库改良水稻品种的方法，涉及分子生物学领域。本发明专利技术通过构建药用野生稻的cDNA文库，并通过农杆菌介导转化进入水稻基因组中，高通量改良水稻品种，在获得的转基因系中筛选具有优良基因特性的个体，转基因系与野生型相比，在株高，分蘖、抽穗期、抗病虫害、耐寒性方面均呈现出明显的变化，考种分析显示部分水稻转基因系与产量提升相关。本发明专利技术具有时间短、效率高、水稻突变性状丰富。对出现变化的水稻植株进行转基因验证分析，遗传背景明确，筛选可利用的优良基因用于后续水稻靶向改良。
【技术实现步骤摘要】
一种转化药用野生稻cDNA文库改良水稻品种的方法
本专利技术涉及分子生物学域，特别涉及一种转化药用野生稻cDNA文库改良水稻品种的方法。
技术介绍
水稻产量关乎世界粮食安全，一直以来都是农业科技工作者关注的焦点和热点。我们目前可以通过各种手段来提高水稻产量，比如施肥打药、科学种田、合理灌溉、发展杂交稻、发展再生稻、三季稻种植、通过转基因技术改良水稻等。随着社会的进步，在我们要建设环境友好型社会和要求食品安全的情况下，大力改良水稻，节约化肥少打药是一个共识，而这里就有两点值得关注，一是发展杂交稻，例如红莲型杂交稻“路优8号”和“洛优10号’，具有高产、优质、广适、节省农药化肥；二是发掘优质基因转化水稻提高水稻产量和抗逆抗病虫害能力，如显著提高水稻产量的药用野生稻基因shrunken-2(Sh2)，Bph14/IS抗褐飞虱基因等。研究发现农杆菌侵染的宿主多，农杆菌转基因先在双子叶植物(如拟南芥和烟草等)中得到了应用，后来在单子叶植物(水稻、药用野生稻、药用野生稻、小麦等)里也得到应用。农杆菌转基因技术的高效和其具有的独特优势，使得多个大型突变体库被构建成功；研究人员可以采用一些方法如接头PCR、环化PCR,TaiL-PCR等鉴定插入位点的侧翼序列，而有的侧翼序列信息己经被提交在网站上供有需要的其他科研工作者参考和分析，好处就是省去了我们费时费力的图位克隆工作。农杆菌介导的转基因技术的优点。1、由于插入的T-DNA序列是己知的，这就可以从正向遗传学方法研究基因和表型的关系，而且克隆基因相对简单些；2、农杆菌转基因虽然会插入多个拷贝，但是相对来说还是很低的，有利于得到纯合的能稳定遗传的单株，符合孟德尔遗传分离定律等；3、目前的研究表明T-DNA插入有偏好性，但是也有随机性，并在大型突变体库的构建中得到了应用。药用野生稻，多年生草本，分布于广西、广东、海南，生于海拔400～1000m处的丘陵地区、坡下冲积地和沟边，存在与栽培稻的基因交换类型，也是水稻育种的原始材料，国家二级保护渐危种。本身没有药用价值，但在中国有“植物大熊猫”之美誉，由于长期处于野生状态，药用野生稻经受各种灾害和环境的自然选择，形成了许多栽培稻很少具有的优良性状，如耐冷性强、超强的分蘖力以及高抗褐飞虱，抗白叶枯病等，是水稻育种和改良品种的重要遗传资源。目前，水稻育种分为传统杂交育种和基因重组育种，传统杂交育种具有遗传背景单一，筛选周期长的缺点，无法高效富集优良基因，基因重组育种又受限于对单一基因的测序、定位和克隆，无法高通量筛选优良的转基因水稻品种。因此，开发一种快速，简单、高效的高通量转化药用野生稻的cDNA文库改良水稻品种的方法十分必要。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题：针对目前对药用野生稻遗传资源利用和水稻育种中存在的问题，本专利技术公开了一种快速，简单、高效的高通量转化药用野生稻的cDNA文库改良水稻品种的方法。为解决上述技术问题，本专利技术提供以下的技术方案：一种转化药用野生稻cDNA文库改良水稻品种的方法，包含以下操作步骤：(1)药用野生稻cDNA文库的构建；(2)药用野生稻cDNA文库序列分析：将E.coil药用野生稻cDNA库中50个随机单克隆测序分析，将测序序列上传到NCBI数据库进行药用野生稻基因BLAST分析，记录相关匹配的信息如匹配的基因登录号、百分数、CDS(codingsequence)、基因注释等，进行cDNA完整性分析和ORF预测；(3)E.coli药用野生稻cDNA文库大规模质粒抽提：(3.1)挑取单菌落于带有相应抗生素的YEB液体培养基中，28℃，250rpm振荡培养20h；(3.2)5mL培养物分3次倒入1.5mL微量离心管中，用微量离心机于4℃，12000rpm离心30s吸去上清再倒入1.5mL的培养物再沉淀细菌；(3.3)向离心管中加入180μL的预冷的Solution1用旋涡震荡器重悬沉淀；(3.4)加入360μL新配制的Solution2盖紧管口，迅速颠倒离心管6～10次，冰上放置10～15min；(3.5)加入270μL预冷的Solution3轻轻混匀，冰上静置20min；(3.6)用微量离心机于4℃以下离心5min，将上清转移到另一离心管中，加等体积的苯酚：氯仿(1：1)，振荡混匀，用微量离心机于4℃以12000rpm离心l0min，将上清转移到另一离心管中；(3.7)向上清中先加入1/10倍体积的醋酸钠再加入2倍体积的无水乙醇，混匀后，-20℃低温放置15min；(3.8)用微量离心机于4℃以12000离心5min弃上清，用70％乙醇洗1～3次，沉定于空气中干燥l0min,用20μLTEbuffer溶解质粒DNA加入1μL10mg/mLRNaseA后用Nanodroping测定质粒的浓度备用；(4)农杆菌感受态细胞的制备，方法如下：挑取农杆菌单菌落接种于5mL含50μg/mL利福平的YEB液体培养基中，28℃，250rpm培养12h；吸取2mL培养物转入50mLYEB液体培养基，继续培养至OD600值为0.8，将菌液转至无菌离心管中，冰浴30min,5000rpm离心5min；用1.7mL的20mmoL/L无菌CaCl2重悬菌体，再加入300微升无菌甘油，混匀后，按每管200μL分装于无菌0.5mL微量离心管中，-70℃保存存备用。(5)药用野生稻目的cDNA过表达文库质粒转入农杆菌，方法如下：(A)首先从-70℃取出农杆菌感受态放置于冰上融解；(B)在200μL的GV3101感受态细胞中加入2mg重组质粒DNA，冰浴5min,然后转至液氮中冷冻8min，迅速于37℃冰浴中温育5min后，加入800μL无抗生素YEB液体培养基，28℃，250rpm预表达培养4h～5h，然后涂铺含有卡那霉素、利福平的YEB平板，28℃培养36h；(C)计数平板上长出的菌落数，挑取单菌落于含有50μg/mL卡那霉素、100μg/mL利福平的YEB液体培养基中摇菌，28℃，250rpm培养12h，5000rpm，离心10min，收集菌体，无菌水洗涤三次后用20％甘油水溶液重悬，-20℃保存备用；(6)农杆菌介导药用野生稻cDNA转化改良水稻品种：(a)选择颖壳干净明亮的、当年的种子，剥去颖壳，在无菌操作台上将其置入100mL灭菌的锥形瓶中，用灭菌的蒸馏水清洗种子3次，再用75％酒精消毒2次，每次1min，然后用灭菌的蒸馏水洗3次除去酒精以后，用0.15％的升汞消毒15min，期间用手摇动锥形瓶，弃去升汞，用灭菌水清洗种子3次，然后将多余的水分除尽，按每平皿10粒种子将种子接种到B5固体培养基上，封口膜封好，28℃黑暗条件下，培养30天；(b)将黄色胚性愈伤组织接种到新的继代培养基上，28℃避光培养25d，挑选亮黄色、干燥的致密胚性愈伤接种到预培养培养基上，此培养基加有终浓度50μg/mL乙酰丁香酮，28℃黑暗条件下培养4天；(c)将含有药用野生稻cDNA的农杆菌涂布于含有50μg/mL卡那霉素、100μg/mL利福平的YEB固体培养基上，28℃黑暗培养24h，在无菌操作台上，用枪头吸取农杆菌悬浮培养基轻轻吹打含有药用野生稻cDNA的农杆菌，然后再吸取这些溶液加入到50mL农杆菌悬浮培养基中，同时加入50μL，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种转化药用野生稻cDNA文库改良水稻品种的方法，其特征在于，包含以下操作步骤：(1)药用野生稻cDNA文库的构建；(2)药用野生稻cDNA文库序列分析：将E.coil药用野生稻cDNA库中50个随机单克隆测序分析，将测序序列上传到NCBI数据库进行药用野生稻基因BLAST分析，记录相关匹配的信息如匹配的基因登录号、百分数、CDS(coding sequence)、基因注释等，进行cDNA完整性分析和ORF预测；(3)E.coli药用野生稻cDNA文库大规模质粒抽提：(3.1)挑取单菌落于带有相应抗生素的YEB液体培养基中，28℃，250rpm振荡培养20h；(3.2)5mL培养物分3次倒入1.5mL微量离心管中，用微量离心机于4℃，12000rpm离心30s吸去上清再倒入1.5mL的培养物再沉淀细菌；(3.3)向离心管中加入180μL的预冷的Solution 1用旋涡震荡器重悬沉淀；(3.4)加入360μL新配制的Solution 2盖紧管口，迅速颠倒离心管6～10次，冰上放置10～15min；(3.5)加入270μL预冷的Solution 3轻轻混匀，冰上静置20min；(3.6)用微量离心机于4℃以下离心5min，将上清转移到另一离心管中，加等体积的苯酚：氯仿(1：1)，振荡混匀，用微量离心机于4℃以12000rpm离心l0min，将上清转移到另一离心管中；(3.7)向上清中先加入1/10倍体积的醋酸钠再加入2倍体积的无水乙醇，混匀后，‑20℃低温放置15min；(3.8)用微量离心机于4℃以12000离心5min弃上清，用70％乙醇洗1～3次，沉定于空气中干燥l0min,用20μL TE buffer溶解质粒DNA加入1μL 10mg/mL RNaseA后用Nanodroping测定质粒的浓度备用；(4)农杆菌感受态细胞的制备，方法如下：挑取农杆菌单菌落接种于5mL含50μg/mL利福平的YEB液体培养基中，28℃，250rpm培养12h；吸取2mL培养物转入50mL YEB液体培养基，继续培养至OD600值为0.5～1.0，将菌液转至无菌离心管中，冰浴30min,5000rpm离心5min；用1.7mL的20mmoL/L无菌CaCl2重悬菌体，再加入300微升无菌甘油，混匀后，按每管200μL分装于无菌0.5mL微量离心管中，‑70℃保存存备用。(5)药用野生稻目的cDNA过表达文库质粒转入农杆菌，方法如下：(A)首先从‑70℃取出农杆菌感受态放置于冰上融解；(B)在200μL的GV3101感受态细胞中加入2mg重组质粒DNA，冰浴5min,然后转至液氮中冷冻8min，迅速于37℃冰浴中温育5min后，加入800μL无抗生素YEB液体培养基，28℃，250rpm预表达培养4h～5h，然后涂铺含有卡那霉素、利福平的YEB平板，28℃培养36h；(C)计数平板上长出的菌落数，挑取单菌落于含有50μg/mL卡那霉素、100μg/mL利福平的YEB液体培养基中摇菌，28℃，250rpm培养12h，5000rpm，离心10min，收集菌体，无菌水洗涤三次后用20％甘油水溶液重悬，‑20℃保存备用；(6)农杆菌介导药用野生稻cDNA转化改良水稻品种：(a)选择颖壳干净明亮的、当年的种子，剥去颖壳，在无菌操作台上将其置入100mL灭菌的锥形瓶中，用灭菌的蒸馏水清洗种子3次，再用75％酒精消毒2次，每次1min，然后用灭菌的蒸馏水洗3次除去酒精以后，用0.15％的升汞消毒15min，期间用手摇动锥形瓶，弃去升汞，用灭菌水清洗种子3次，然后将多余的水分除尽，按每平皿10粒种子将种子接种到B5固体培养基上，封口膜封好，28℃黑暗条件下，培养30天；(b)将黄色胚性愈伤组织接种到新的继代培养基上，28℃避光培养25d，挑选亮黄色、干燥的致密胚性愈伤接种到预培养培养基上，此培养基加有终浓度50μg/mL乙酰丁香酮，28℃黑暗条件下培养4天；(c)将含有药用野生稻cDNA的农杆菌涂布于含有50μg/mL卡那霉素、100μg/mL利福平的YEB固体培养基上，28℃黑暗培养24h，在无菌操作台上，用枪头吸取农杆菌悬浮培养基轻轻吹打含有药用野生稻cDNA的农杆菌，然后再吸取这些溶液加入到50mL农杆菌悬浮培养基中，同时加入50μL，50mg/mL的乙酰丁香酮，标定OD600为0.8，然后加入在AS上生长5天的愈伤组织，42℃条件下热激30min；(d)在无菌操作台上尽量除尽菌液，将愈伤组织摊开置于已经灭菌的带有滤纸平皿上吹风1h，直到愈伤组织表面水分被吹干，随后，将其转移到共培养培养基上，24℃，黑暗下培养5d；(e)在无菌操作台上，将共培养后的愈伤组织放到大小为250mL三角瓶里，用2L灭菌的ddH2O洗5次，用含100μg/mL利福平的无菌...
【技术特征摘要】
1.一种转化药用野生稻cDNA文库改良水稻品种的方法，其特征在于，包含以下操作步骤：(1)药用野生稻cDNA文库的构建；(2)药用野生稻cDNA文库序列分析：将E.coil药用野生稻cDNA库中50个随机单克隆测序分析，将测序序列上传到NCBI数据库进行药用野生稻基因BLAST分析，记录相关匹配的信息如匹配的基因登录号、百分数、CDS(codingsequence)、基因注释等，进行cDNA完整性分析和ORF预测；(3)E.coli药用野生稻cDNA文库大规模质粒抽提：(3.1)挑取单菌落于带有相应抗生素的YEB液体培养基中，28℃，250rpm振荡培养20h；(3.2)5mL培养物分3次倒入1.5mL微量离心管中，用微量离心机于4℃，12000rpm离心30s吸去上清再倒入1.5mL的培养物再沉淀细菌；(3.3)向离心管中加入180μL的预冷的Solution1用旋涡震荡器重悬沉淀；(3.4)加入360μL新配制的Solution2盖紧管口，迅速颠倒离心管6～10次，冰上放置10～15min；(3.5)加入270μL预冷的Solution3轻轻混匀，冰上静置20min；(3.6)用微量离心机于4℃以下离心5min，将上清转移到另一离心管中，加等体积的苯酚：氯仿(1：1)，振荡混匀，用微量离心机于4℃以12000rpm离心l0min，将上清转移到另一离心管中；(3.7)向上清中先加入1/10倍体积的醋酸钠再加入2倍体积的无水乙醇，混匀后，-20℃低温放置15min；(3.8)用微量离心机于4℃以12000离心5min弃上清，用70％乙醇洗1～3次，沉定于空气中干燥l0min,用20μLTEbuffer溶解质粒DNA加入1μL10mg/mLRNaseA后用Nanodroping测定质粒的浓度备用；(4)农杆菌感受态细胞的制备，方法如下：挑取农杆菌单菌落接种于5mL含50μg/mL利福平的YEB液体培养基中，28℃，250rpm培养12h；吸取2mL培养物转入50mLYEB液体培养基，继续培养至OD600值为0.5～1.0，将菌液转至无菌离心管中，冰浴30min,5000rpm离心5min；用1.7mL的20mmoL/L无菌CaCl2重悬菌体，再加入300微升无菌甘油，混匀后，按每管200μL分装于无菌0.5mL微量离心管中，-70℃保存存备用。(5)药用野生稻目的cDNA过表达文库质粒转入农杆菌，方法如下：(A)首先从-70℃取出农杆菌感受态放置于冰上融解；(B)在200μL的GV3101感受态细胞中加入2mg重组质粒DNA，冰浴5min,然后转至液氮中冷冻8min，迅速于37℃冰浴中温育5min后，加入800μL无抗生素YEB液体培养基，28℃，250rpm预表达培养4h～5h，然后涂铺含有卡那霉素、利福平的YEB平板，28℃培养36h；(C)计数平板上长出的菌落数，挑取单菌落于含有50μg/mL卡那霉素、100μg/mL利福平的YEB液体培养基中摇菌，28℃，250rpm培养12h，5000rpm，离心10min，收集菌体，无菌水洗涤三次后用20％甘油水溶液重悬，-20℃保存备用；(6)农杆菌介导药用野生稻cDNA转化改良水稻品种：(a)选择颖壳干净明亮的、当年的种子，剥去颖壳，在无菌操作台上将其置入100mL灭菌的锥形瓶中，用灭菌的蒸馏水清洗种子3次，再用75％酒精消毒2次，每次1min，然后用灭菌的蒸馏水洗3次除去酒精以后，用0.15％的升汞消毒15min，期间用手摇动锥形瓶，弃去升汞，用灭菌水清洗种子3次，然后将多余的水分除尽，按每平皿10粒种子将种子接种到B5固体培养基上，封口膜封好，28℃黑暗条件下，培养30天；(b)将黄色胚性愈伤组织接种到新的继代培养基上，28℃避光培养25d，挑选亮黄色、干燥的致密胚性愈伤接种到预培养培养基上，此培养基加有终浓度50μg/mL乙酰丁香酮，28℃黑暗条件下培养4天；(c)将含有药用野生稻cDNA的农杆菌涂布于含有50μg/...
【专利技术属性】
技术研发人员：乔保建，夏祥华，任代胜，付锡江，陶元平，彭冲，
申请(专利权)人：安徽袁粮水稻产业有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34
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