用于猕猴桃东红品种鉴定的分子标记引物及应用制造技术

本发明专利技术属于分子生物学及遗传育种技术领域，更具体涉及用于猕猴桃‘东红’品种鉴定的分子标记引物及应用，所述的引物为：Geo19‑159‑F:TGATTCGTTTTGACACAATGG和Geo19‑159‑R:TGCAGGCTATGGACTGAGTG。利用本发明专利技术提供的引物对东红DNA进行扩增，仅东红可特异性的扩增出280bp和282bp的条带；根据不同条带的大小和数目，也可对：楚红、GT815、H‑15、华光2号、华优、海沃德、龙山红、满天红、磨山雄5号、秦美、QS‑5、通山5号、WH‑1或厦亚1号猕猴桃进行区分。

【技术实现步骤摘要】
用于猕猴桃东红品种鉴定的分子标记引物及应用
本专利技术属于分子生物学及遗传育种
，更具体涉及用于猕猴桃‘东红’品种鉴定的分子标记引物及应用。
技术介绍
中国是猕猴桃属植物的原产地和猕猴桃遗传资源的原始起源中心。近年来，我国猕猴桃产业稳步扩增，截至2017年全国栽培面积达240万亩，产量290万吨，均居世界首位。在品种格局上，我国立足于本土猕猴桃遗传资源研究，选育出了‘金艳’、‘东红’等猕猴桃新品种，在全球范围广泛栽培，彻底改变了世界猕猴桃产业唯‘海沃德’品种的单一格局，推动了猕猴桃市场多样化和消费的多元化。随着猕猴桃新品种的日益推出，新品种的鉴定是亟待解决的一大难题。目前，对猕猴桃专利品种的鉴定仅通过树势、叶片形态、花期、花形态、果实外观等传统手段，难免受到环境和其他人为因素的影响。对猕猴桃品种的不确定性，限制了产业的健康持续发展，且苗木品种不纯甚至错误将造成果农经济效益严重受损。分子标记技术能快速、准确、高效对品种进行鉴定,对保证农业生产中品种的正确性具有重要的意义。选择适宜的分子标记及其配套检测技术,建立一套简便、经济、准确而高效的品种鉴定和指纹图谱技术体系,是打击假冒伪劣种苗、保护植物遗传育种工作者和农民的合法权益，规范我国农业市场的迫切需要。分子标记技术通过检测生物个体在基因组上产生的变异，从而对不同个体进行区分，是继形态标记和生化标记之后，发展的一种较为理想的遗传标记。在植物种质资源鉴定及育种中，对分子标记的应用已日趋成熟。SSR分子标记数量丰富且随机均匀分布于基因组，呈共显性，等位变异高，操作简便且稳定性好，已应用于大豆、苹果和葡萄等品种鉴定方面。在猕猴桃中，分子标记技术应用于猕猴桃雄性系列品种的鉴定，已为多个优异猕猴桃品种准确提供授粉雄株，提升猕猴桃的育种效率。‘东红’猕猴桃单果重在80-130克，果实为短圆柱形，果皮无毛绿褐色，果肉多汁，酸甜适中。总糖含量高达13.45﹪，而总酸只有0.49﹪，可溶性固形物16.5﹪，富含钙、铁、钾等多种矿物质及17种氨基酸。开发适用于猕猴桃‘东红’品种的分子鉴定标记，有利于从分子水平上明确界定专利品种，利于对猕猴桃品种进行鉴定和品种保护。
技术实现思路
本专利技术的目的在于利用分子标记技术，提供一种用于猕猴桃‘东红’品种鉴定的分子标记引物，所述的分子标记命名为Geo19-159，针对其设计的引物为Geo19-159-F:TGATTCGTTTTGACACAATGG和Geo19-159-R:TGCAGGCTATGGACTGAGTG。本专利技术的另一个目的在于提供了用于猕猴桃‘东红’品种鉴定的分子标记引物在猕猴桃育种中的应用。为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：用于猕猴桃‘东红’品种鉴定的分子标记引物的获得：申请人从猕猴桃基因组序列网站(http://bioinfo.bti.cornell.edu/kiwi)下载‘红阳’猕猴桃全基因序列。通过SSRFinder软件在全基因组范围内开发SSR标记，根据基因结构注释结果，选择基因位点设计SSR标记引物。利用设计合成的引物，对猕猴桃‘东红’品种进行PCR扩增，筛选得到分子标记Geo19-159，针对其设计的引物为Geo19-159-F:TGATTCGTTTTGACACAATGG和Geo19-159-R:TGCAGGCTATGGACTGAGTG。用于猕猴桃‘东红’品种鉴定的分子标记引物在猕猴桃育种中的应用，包括利用本专利技术的引物用于猕猴桃育种，或是利用本专利技术的引物对猕猴桃品种，特别是‘东红’品种进行鉴定，仅‘东红’猕猴桃可特异性的扩增得280bp和282bp的片段，或是根据不同条带的大小和数目，对不同品种包括：‘楚红’、‘GT815’、‘H-15’、‘华光2号’、‘华优’、‘海沃德’、‘龙山红’、‘满天红’、‘磨山雄5号’、‘秦美’、‘QS-5’、‘通山5号’、‘WH-1’或‘厦亚1号’猕猴桃进行区分。与现有技术相比，本专利技术的优点：1.形态标记简单直观，但是数量少、多态性差、易受环境条件影响。分子标记操作简便，在植物体的各个组织和发育时期，均可检测，不受季节和环境限制。数量多，遍及整个基因组。多态性高，品种间存在许多等位变异。2.本专利技术的引物可在猕猴桃系列品种中扩增得到不同大小的DNA片段。该分子标记扩增稳定性，能用于进行猕猴桃‘东红’品种的鉴定。3.本专利技术提供的分子标记引物特异性高，适用范围广，可从40多个不同品种的猕猴桃中对‘东红’品种进行鉴定，利用分子标记Geo19-159引物对‘东红’DNA进行扩增，仅东红可特异性的扩增出280bp和282bp的条带。4.除了根据特异性条带鉴定‘东红’品种，还可根据条带大小和数目对‘楚红’、‘GT815’、‘H-15’、‘华光2号’、‘华优’、‘海沃德’、‘龙山红’、‘满天红’、‘磨山雄5号’、‘秦美’、‘QS-5’、‘通山5号’、‘WH-1’或‘厦亚1号’猕猴桃进行区分。具体实施方式本专利技术所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业或公开的渠道。实施例1：用于猕猴桃‘东红’品种鉴定的分子标记引物的获得：申请人从猕猴桃基因组序列网站(http://bioinfo.bti.cornell.edu/kiwi)下载‘红阳’猕猴桃全基因序列。通过SSRFinder软件在全基因组范围内开发SSR标记，根据基因结构注释结果，选择基因位点设计SSR标记引物。利用设计合成的引物，对猕猴桃‘东红’品种进行PCR扩增，筛选得到分子标记Geo19-159，针对其设计的引物为Geo19-159-F:TGATTCGTTTTGACACAATGG和Geo19-159-R:TGCAGGCTATGGACTGAGTG。实施例2：用于猕猴桃‘东红’品种鉴定的分子标记引物在品种鉴定中的应用：(1)按照CTAB法分别提取40多个不同品种猕猴桃的DNA样品(具体品种名称如表1所示)。(2)使用加样器吸取990ulHIDI和10ulROX500或LIZ500的混合物，加入到96孔反应板中，每孔10ul。(3)将96孔板置于平板离心机中，离心500g即停。(4)在96孔板对应的孔中分别加入各样本DNA，每个样品50pg。(5)参照以下PCR反应体系加入相应试剂到96孔板，使用封板膜密封96孔板，振荡，将96孔板置于平板离心机中，离心500g即停。按照以下程序进行PCR反应。a.PCR反应体系25μl体系的配制所述的引物F和引物R为：Geo19-159-F:TGATTCGTTTTGACACAATGG和Geo19-159-R:TGCAGGCTATGGACTGAGTG。b.PCR反应条件(6)程序结束后立即将96孔板置于冰水混合物上急速冷却，再将96孔板置于平板离心机中，离心2000g即停。(7)使用3730xl测序分析仪(美国ABI公司)检测扩增片段。(8)使用Genemapper软件分析SSR扩增数据，利用STR毛细管电泳检测扩增片段峰，横坐标为片段大小，纵坐标为荧光强度值。(9)利用标记Geo19-159扩增猕猴桃品种，仅‘东红’猕猴桃扩增得到280bp和282bp的特异条带，同时根据不同条带的大小和数目，对不同品种包括：‘楚红’、‘GT815’、‘H-15’、‘华本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于猕猴桃东红品种鉴定的分子标记引物，所述的引物为： Geo19‑159‑F:TGATTCGTTTTGACACAATGG和Geo19‑159‑R:TGCAGGCTATGGACTGAGTG。

【技术特征摘要】
1.用于猕猴桃东红品种鉴定的分子标记引物，所述的引物为：Geo19-159-F:TGATTCGTTTTGACACAATGG和Geo19-159-R:TGCAGGCTATGGACTGAGTG。2.权利要求1所述的引物在猕猴桃育种中的应用。3.权利要求1所述的引物在猕猴桃品种鉴定中的应用。4.权利要求1所述的引物在猕猴桃东红品种鉴定中的应用。5.权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟彩虹，张琼，黄宏文，陈美艳，
申请(专利权)人：中国科学院武汉植物园，
类型：发明
国别省市：湖北,42