本发明专利技术属于分子生物学DNA标记技术与应用领域。公开了一种用于新疆葱蒜野生近缘种遗传多样性分析的TRAP标记引物组合及其应用。本发明专利技术提供引物组合的核苷酸序列如SEQ ID No.1至SEQ ID No.6所示。本发明专利技术提供TRAP‑PCR反应体系中dNTPs浓度为0.250 mmol/L、引物浓度为0.250μmol/L、Taq酶用量为0.750 U和模板DNA用量为75.000 ng，所得到的条带清晰、重复性好、多态性高的引物组合，能够准确可靠地进行遗传分析，本发明专利技术提供的引物组合的高效性及实用性弥补了TRAP标记在新疆葱蒜野生近缘种研究上的应用。
【技术实现步骤摘要】
一种用于新疆葱蒜野生近缘种遗传多样性分析的TRAP标记引物组合及其应用
本专利技术属于分子生物学DNA标记技术与应用领域，具体涉及一种用于新疆葱蒜野生近缘种遗传多样性分析的TRAP引物组合及其应用。
技术介绍
葱蒜植物按照APGIV划分属于石蒜科（Amaryllidaceae）葱属（AlliumL.）多年生草本植物。新疆境内的天山山脉以北、阿尔泰山脉以南、昆仑山脉以北的山地森林草原、山麓荒地、干旱荒漠和干旱草原灌丛等地蕴藏着大蒜、韭菜、大葱和洋葱等的野生近缘种，由于特殊的地理环境，有些葱蒜植物的野生近缘种国内仅分布于新疆，不仅是重要的观赏、食用、药用、蔬菜和饲养植物资源，而且是国内葱属植物种质创新的宝贵的基因材料，例如，实葶葱（A.galanthum）、新疆蒜（A.roborowskianum）、多籽蒜（A.fetisowii）、健蒜（A.robustum）、棱叶韭（A.caeruleum）、小山蒜（A.pallasii）等，具有较高的经济开发和利用价值。开展新疆葱蒜野生近缘种的遗传多样性和亲缘关系分析，为揭示野生近缘种物种演化和系统关系、种质资源保护和生态安全尤为重要，目前对新疆野生葱蒜植物的种植资源遗传多样性和亲缘关系分析是基于生态适应性、形态特征、细胞学鉴定、ISSR标记等方面展开，随着遗传多样性分析技术的进步，种质资源的分类学鉴定和亲缘关系鉴定还需要开展更广泛、更深层次的分子生物学评价，需要新的分子标记引物组合的应用。表达序列标签（EST序列）是从随机选择的互补DNA（或cDNA）分子所获得的DNA（或cDNA）部分基因表达序列，代表着在特定的环境条件下，特定的组织细胞基因表达的序列。本专利技术提供了一种TRAP分子标记，且所述的TRAP标记是基于葱属植物的EST序列设计的引物，基于TRAP标记开展的葱蒜野生近缘种遗传多样性进行分析，为葱属野生种质资源验证基因在特定组织中的表达，推导全长基因序列，或作为标签标志基因组中的特殊位点以确定基因的位置等具有重要的指导意义。基于分子标记的葱属植物遗传多样性研究主要集中在ISSR、SSR、RAPD等标记上，靶位区域扩增多态性（Targetregionamplifiedpolymorphism,TRAP）分子标记与其他标记不同的是依据已知的目的基因的cDNA或EST基因序列设计固定引物，并结合随机引物对目标区域进行多态性扩增，从而产生围绕已知目的基因的多态性的分子标记。TRAP分子标记具有操作简单、重复性好、效率高、稳定性好等特点，已在洋葱遗传多样性分析（AnandhanS，NairA，KumkarDS，GopalJ.RetrotransposonbasedTRAPmarkerdisplaysdiversityamongonion(Alliumcepa,L.)genotypes.ScientiaHorticulturae，2015，190：123-127）、短日照洋葱种质鉴定得到成功运用（KishaTJ，CramerCS.DeterminingredundancyofShort-dayOnionaccessionsinagermplasmcollectionusingMicrosatelliteandTargetedRegionAmplifiedPolymorphicMarkers.JournaloftheAmericanSocietyforHorticulturalScienceAmericanSociety，2011，136(2)：129-134），但在葱属植物的遗传图谱构建、重要性状的标记、相关基因的克隆等其他研究上还未见报道，尤其是TRAP标记引物组合以及应用该技术在新疆葱蒜野生近缘种进行遗传多样性的分析尚未见报道。
技术实现思路
为填补在新疆葱蒜野生近缘种之间缺乏应用TRAP标记引物组合开展遗传多样性特征分析技术方法的空白，本专利技术公开了一种用于鉴定新疆葱蒜野生近缘种遗传多样性的特有的TRAP分子标记引物组合，其次，本专利技术还公开了应用TRAP分子标记引物组合开展新疆葱蒜野生近缘种遗传多样性分析的具体方法。本专利技术所述的新疆葱蒜野生近缘种为阿尔泰蒜、奇台蒜、多籽蒜、健蒜、新疆蒜、喀纳斯蒜、乌鲁木齐蒜、棱叶蒜、小山蒜及实葶葱共计10种野生种。本专利技术提供的用于分析新疆葱蒜野生近缘种遗传多样性分析的TRAP标记的3条固定引物（FY-F1、FS-F1、FS-F2）和3条随机引物（FY-R1、FS-R1、FS-R2）。所述的TRAP标记引物FY-F1、FS-F1、FS-F2、FY-R1、FS-R1、FS-R2的命名如下所示：SEQIDNo.1的核苷酸序列被命名为FY-F1；SEQIDNo.2的核苷酸序列被命名为FS-F1；SEQIDNo.3的核苷酸序列被命名为FS-F2；SEQIDNo.4的核苷酸序列被命名为FY-R1；SEQIDNo.5的核苷酸序列被命名为FS-R1；SEQIDNo.6的核苷酸序列被命名为FS-R2。所述的引物组合包括如下a-i引物组合的至少一个组合：a.引物组合FY-F1+FY-R1；b.引物组合FY-F1+FS-R1；c.引物组合FY-F1+FS-R2；d.引物组合FS-F1+FY-R1；e.引物组合FS-F1+FS-R1；f.引物组合FS-F1+FS-R2；g.引物组合FS-F2+FY-R1；h.引物组合FS-F2+FS-R1；i.引物组合FS-F2+FS-R2；应用本专利技术用于新疆葱蒜野生近缘种遗传多样性分析的TRAP标记引物组合及其应用，具体方法包括：（1）提取新疆葱蒜野生近缘种基因组DNA；（2）以所述的基因组DNA为模板，使用权利5所述的引物组合进行PCR扩增；（3）根据PCR扩增产物，鉴定所述的引物组合是否适于新疆葱蒜野生近缘种的遗传多样性分析。优选的，FS-F1+FS-R2、FS-F2+FS-R2二对引物组合被最终确定为用于分析新疆葱蒜野生近缘种的TRAP-PCR引物组合。优选的，所述的TRAP-PCR反应体系为：dNTPs浓度为0.250mmol/L、引物浓度为0.250μmol/L、Taq酶用量为0.750U和模板DNA用量为75.000ng。进一步确定TRAP-PCR在进行35个循环阶段采用的退火温度在52.0℃~55.6℃之间，最优选的退火温度为53.2℃，TRAP-PCR具体步骤为：94℃预变性3min；94℃变性45s，37℃退火45s，72℃延伸1min，循环5次；94℃变性45s，53.2℃退火45s，72℃延伸1min，循环35次；72℃延伸5min。本专利技术所提供的TRAP分子标记引物实现对疆葱蒜野生近缘种遗传多样性分析，在葱属植物的遗传多样性研究方面具有一定的应用前景。本专利技术与现有技术相比，具有以下有益效果为：本专利技术弥补了目前TRAP分子标记在新疆葱蒜野生近缘种研究上的空白。TRAP分子标记进一步于新的分子标记方面对新疆葱蒜野生近缘种的遗传多样性进行更深一层的分析与评价，填补了新的分子标记在新疆葱蒜野生近缘种研究方面的不足。TRAP分子标记是依据目标序列进行引物设计，对基因组DNA质量要求不高，检测结果重复性好，多态性高，能快速、准确、高效的完成新疆葱蒜野生近缘种的遗传多样性分析，进一步说明了TRAP引物的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种TRAP分子标记，其特征在于，所述的分子标记用于新疆葱蒜野生近缘种遗传多样性分析。
【技术特征摘要】
1.一种TRAP分子标记，其特征在于，所述的分子标记用于新疆葱蒜野生近缘种遗传多样性分析。2.一种用于新疆葱蒜野生近缘种遗传多样性分析的TRAP标记引物组合及其应用，其特征在于，所述的新疆葱蒜野生近缘种为阿尔泰蒜、奇台蒜、多籽蒜、健蒜、新疆蒜、喀纳斯蒜、乌鲁木齐蒜、棱叶蒜、小山蒜及实葶葱。3.根据权利要求2所述的用于新疆葱蒜野生近缘种遗传多样性分析的TRAP标记引物组合及其应用，其特征在于，所述的TRAP标记引物为3条固定引物（FY-F1、FS-F1、FS-F2）和3条随机引物（FY-R1、FS-R1、FS-R2）。4.根据权利要求2所述的用于新疆葱蒜野生近缘种遗传多样性分析的TRAP标记引物组合及其应用，其特征在于，所述的TRAP标记引物FY-F1、FS-F1、FS-F2、FY-R1、FS-R1、FS-R2的命名如下所示：SEQIDNo.1的核苷酸序列被命名为FY-F1；SEQIDNo.2的核苷酸序列被命名为FS-F1；SEQIDNo.3的核苷酸序列被命名为FS-F2；SEQIDNo.4的核苷酸序列被命名为FY-R1；SEQIDNo.5的核苷酸序列被命名为FS-R1；SEQIDNo.6的核苷酸序列被命名为FS-R2。5.根据权利要求2所述的用于分析新疆葱蒜野生近缘种遗传多样性分析的TRAP标记引物组合及其应用，其特征在于，步骤（2）中所述的引物组合包括如下a-i引物组合的至少一个组合：a.引物组合FY-F1+FY-R1；b.引物组合FY-F1+FS-R1；c.引物组合FY-F1+FS-R2；d.引物组合FS-F1+FY-R1；e.引物组合FS-F1+FS-R1；f.引物组合FS-F1+FS-R2；g.引物组合FS-F2+FY-R1；h.引物组合FS-F2+FS-R1；i.引...
【专利技术属性】
技术研发人员：林辰壹，王丹丹，
申请(专利权)人：新疆农业大学，
类型：发明
国别省市：新疆,65
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。