牛贾第虫、隐孢子虫多重PCR检测试剂盒及其方法技术

本发明专利技术公开一种牛贾第虫、隐孢子虫多重PCR检测试剂盒及其方法，根据十二指肠贾第虫TPI基因、微小隐孢子虫18S rRNA基因与安氏隐孢子虫18S rRNA基因的部分保守序列设计引物，建立三重PCR检测方法，通过优化PCR反应的退火温度等反应条件来提高其灵敏性和准确性，扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后观察结果方便、快捷。本发明专利技术扩增的三种目的片段在琼脂糖凝胶电泳中大小差异显著，易于区分，且敏感性可达到1×10

【技术实现步骤摘要】
牛贾第虫、隐孢子虫多重PCR检测试剂盒及其方法
本专利技术提供一种同时检测牛十二指肠贾第虫(Giardiaduodenalis,G.duodenalis)、微小隐孢子虫（C.parvum）与安氏微小隐孢子虫(C.andersoni)三重PCR检测方法，本专利技术还提供了该试剂盒的制备方法和用法，属于寄生虫检测

技术介绍
贾第虫（Giardia）与隐孢子虫(Cryptosporidium)属于重要的人兽共患病原虫，隐孢子虫包括微小隐孢子虫（C.parvum）与安氏隐孢子虫(C.andersoni)等，主要引起幼龄动物的消化道和呼吸道疾病，导致其生产性能下降或死亡。贾第虫又分为6种，包括敏捷贾第虫(Giardiaagi-lis)、苍鹭贾第虫(Giardiaardeae)、鹦鹉贾第虫(Giardiapsittaci)、微小贾第虫(Giardiamicroti)、鼠贾第虫(Giardiamuris)和十二指肠贾第虫(Giardiaduodenalis,G.duodenalis)，有些文献也称为蓝氏贾第鞭毛虫(Giardialamblia)或肠贾第虫(Giardiain-testinalis)，其中十二指肠贾第虫是唯一可感染人类的贾第虫,同时可以感染包括宠物和家畜在内的其他哺乳动物。贾第虫（Giardia）与隐孢子虫(Cryptosporidium)感染宿主广，感染后临床症状以腹泻为主，并对畜牧业与养殖业造成巨大的经济损失。牛作为重要的实验用动物，利用于大量的基础性实验当中，其身体健康状态直接影响实验数据以及实验人员的人身安全。牛是中国传统养殖业的典型动物，随着牛场养殖规模的不断扩大，对于牛群寄生虫快速检测的需要日趋增加。目前对安氏隐孢子虫、微小隐孢子虫与十二指肠贾第虫的检测方法主要为三种，分别为病原学检测方法、免疫学检测方法和分子生物学检测方法，而在此之中被使用最多的是病原学检测方法，通过显微镜下检测粪便中的卵囊，来对安氏隐孢子虫、微小隐孢子虫和十二指肠贾第虫进行确诊，但该方法具有费时费力，敏感性，特异性均不高，且不能辨别虫种和基因型的缺点。制备三重PCR检测试剂盒，可以在同一体系中快速检测牛十二指肠贾第虫(Giardiaduodenalis,G.duodenalis)、微小隐孢子虫（C.parvum）与安氏微小隐孢子虫(C.andersoni)，比普通的显微镜下检测粪便中的卵囊以及单项PCR等方法都要更加简便快速、特异、敏感。这大大提高了检测这三种寄生虫的效率与准确性。
技术实现思路
本专利技术提供一种能同时检测实验用牛十二指肠贾第虫、微小隐孢子虫与安氏微小隐孢子虫三重PCR检测试剂盒，可用于牛十二指肠贾第虫、微小隐孢子虫与安氏微小隐孢子虫的快速检测。本专利技术进一步提供了上述试剂盒的制备方法。本专利技术牛十二指肠贾第虫、微小隐孢子虫与安氏微小隐孢子虫三重PCR检测试剂盒的组成材料：（1）PCR反应液：2.5mMdNTPs、终浓度为10pmol/μL的上游引物和下游引物、10×PCRbuffer，rTaqDNA聚合酶、DNA模板和ddH2O；（2）三重PCR引物(均15pM)：十二指肠贾第虫PCR引物：F1：5'-CGACCTGACTATGACCAACTC-3'；R1：5'-GTCCTGAAGCATCTCAACACT-3'；微小隐孢子虫PCR引物：F2：5'-CCTTACTCCTTCAGCACCTTATG-3'；R2：5'-TGTTACGACTTCTCCTTCCTCTAA-3'；安氏隐孢子虫PCR引物：F3：5'-TACCGTGGCTATGACGGGTA-3'；R3：5'-CACCAGACTTGCCCTCCAAT-3'；（3）阳性对照：阳性对照的粪便基因组DNA模板为十二指肠贾第虫、微小隐孢子虫与安氏微小隐孢子虫基因组DNA，用于比较三重PCR产物以及监测三重PCR操作过程是否正确；（4）阴性对照：阴性对照的模板为灭菌ddH2O，目的在排除反应液中的核酸污染和操作过程中的假阳性问题。本专利技术的试剂盒还含有琼脂糖（Agarose）、溴酚蓝点样缓冲液和溴化乙锭，(E.B)10μg/μl及PCR反应管。本专利技术所述的牛十二指肠贾第虫、微小隐孢子虫与安氏微小隐孢子虫检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：1)三重PCR引物(均15pM)：十二指肠贾第虫PCR引物：F1：5'-CGACCTGACTATGACCAACTC-3'；R1：5'-GTCCTGAAGCATCTCAACACT-3'；微小隐孢子虫PCR引物：F2：5'-CCTTACTCCTTCAGCACCTTATG-3'；R2：5'-TGTTACGACTTCTCCTTCCTCTAA-3'；安氏隐孢子虫PCR引物：F3：5'-TACCGTGGCTATGACGGGTA-3'；R3：5'-CACCAGACTTGCCCTCCAAT-3'；2)粪便基因组DNA的提取：使用生物公司出售的粪便基因组DNA提取试剂盒，提取牛粪便中的十二指肠贾第虫、微小隐孢子虫与安氏微小隐孢子虫基因组DNA。3）PCR扩增：（1）准备待检样品的PCR反应管并分别标记，管内加入PCR反应液，然后加入引物、基因组DNA模板和rTaqPolymerase(5U/μl)，涡旋混匀后瞬时离心后，放入PCR仪中，设置PCR反应条件。（2）PCR反应条件为：94℃预变性3min、94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸1min，共32个循环，后72℃延伸10min。4）PCR产物观察：配制1.0%琼脂糖凝胶(加入浓度0.5μg/mL的E.B)，加样后120V-145V电压下电泳18-25min，之后在紫外灯或凝胶成像系统下观察实验结果，若样品在447bp(十二指肠贾第虫)、700bp（微小隐孢子虫）或223bp（安氏隐孢子虫）大小处存在条带就证明该样品为阳性。本专利技术的积极效果在于：根据十二指肠贾第虫TPI基因、微小隐孢子虫18SrRNA基因与安氏隐孢子虫18SrRNA基因的部分保守序列设计引物，建立三重PCR检测方法，并且通过优化PCR反应的退火温度等反应条件来提高其灵敏性和准确性，扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后观察结果方便、快捷。不同目的片段的区分是多重PCR检测方法建立的关键之一，本试剂盒扩增的三种目的片段在琼脂糖凝胶电泳中大小差异显著，易于区分，且敏感性可达到1×103/g粪便，高于三种寄生虫已报导的镜检法与常规PCR检测方法，适合于临床实践中样本的检测。本专利技术检测方法可以同时快速检测牛的十二指肠贾第虫、微小隐孢子虫与安氏隐孢子虫，具有操作简单、灵敏度高、特异性强等特点。同时为实验用实牛的质量标准提供技术支持。附图说明图1：三重PCR退火温度的优化图；图2：三重PCR特异性试验图；图3：三重PCR灵敏度试验图；图4：三重PCR实际应用图。具体实施方式下列实施例旨在进一步举例说明，而不是限制本专利技术。本领域技术人员可以理解到，在不背离本专利技术的精神和原则的前提下，对本专利技术的任何平行改变和改动都将落入本专利技术的待批权利要求范围内。实施例1十二指肠贾第虫、微小隐孢子虫与安氏隐孢子虫特异基因选择十二指肠贾第虫、微小隐孢子虫与安氏隐孢子虫虫种特异诊断序列：选择具有高度保守性的TPI基因与18SrRNA基因序列，NCBI本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于扩增牛十二指肠贾第虫、微小隐孢子虫、安氏隐孢子虫的nest‑PCR扩增引物，具有以下序列：十二指肠贾第虫PCR引物：F1 ：5'‑CGACCTGACTATGACCAACTC‑3'；R1 ：5'‑GTCCTGAAGCATCTCAACACT‑3'；微小隐孢子虫PCR引物：F2：5'‑CCTTACTCCTTCAGCACCTTATG‑3'；R2 ：5'‑TGTTACGACTTCTCCTTCCTCTAA‑3'；安氏隐孢子虫PCR引物：F3：5'‑TACCGTGGCTATGACGGGTA‑3'；R3：5'‑CACCAGACTTGCCCTCCAAT‑3'；所述的牛十二指肠贾第虫特异基因序列如SEQ No.1所示；所述的微小隐孢子虫特异基因序列如SEQ No.4所示；所述的安氏隐孢子虫特异基因序列如SEQ No.7所示。

【技术特征摘要】
1.用于扩增牛十二指肠贾第虫、微小隐孢子虫、安氏隐孢子虫的nest-PCR扩增引物，具有以下序列：十二指肠贾第虫PCR引物：F1：5'-CGACCTGACTATGACCAACTC-3'；R1：5'-GTCCTGAAGCATCTCAACACT-3'；微小隐孢子虫PCR引物：F2：5'-CCTTACTCCTTCAGCACCTTATG-3'；R2：5'-TGTTACGACTTCTCCTTCCTCTAA-3'；安氏隐孢子虫PCR引物：F3：5'-TACCGTGGCTATGACGGGTA-3'；R3：5'-CACCAGACTTGCCCTCCAAT-3'；所述的牛十二指肠贾第虫特异基因序列如SEQNo.1所示；所述的微小隐孢子虫特异基因序列如SEQNo.4所示；所述的安氏隐孢子虫特异基因序列如SEQNo.7所示。2.一种牛贾第虫、隐孢子虫多重PCR检测试剂盒，其特征在于：（1）配制牛十二指肠贾第虫、微小隐孢子虫、安氏隐孢子虫的PCR反应液：2.5mMdNTPs、终浓度为10pmol/μL的上游引物和下游引物、10×PCRbuffer，rTaqDNA聚合酶、DNA模板和ddH2O；（2）如权利要求1所说牛十二指肠贾第虫、微小隐孢子虫、安氏隐孢子虫的三重PCR引物：（3）阳性对照：阳性对照的粪便基因组DNA模板为十二指肠贾第虫、微小隐孢子虫与安氏微小隐孢子虫基因组DNA，用于比较三重PCR产物以及监测三重PCR操作过程是否正确；（4）...

【专利技术属性】
技术研发人员：宫鹏涛，张西臣，高宇航，李显赫，任文陟，李建华，杨举，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林,22