羊贾第虫与隐孢子虫双重PCR检测试剂盒及其方法技术

本发明专利技术公开一种羊贾第虫与隐孢子虫双重PCR检测试剂盒及其方法，根据十二指肠贾第虫TPI基因、微小隐孢子虫18S rRNA基因部分保守序列设计引物，建立双重PCR检测方法，并且通过优化PCR反应的退火温度等反应条件来提高其灵敏性和准确性，扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后观察结果方便、快捷。不同目的片段的区分是双重PCR检测方法建立的关键之一，本发明专利技术扩增的两种目的片段在琼脂糖凝胶电泳中大小差异显著，易于区分，且敏感性可达到5×10

【技术实现步骤摘要】
羊贾第虫与隐孢子虫双重PCR检测试剂盒及其方法
本专利技术提供一种同时检测羊十二指肠贾第虫(Giardiaduodenalis,G.duodenalis)、微小隐孢子虫（C.parvum）双重PCR检测方法，本专利技术还提供了该试剂盒的制备方法和用法，属于寄生虫检测

技术介绍
贾第虫（Giardia）与隐孢子虫(Cryptosporidium)属于重要的人兽共患病原虫，其感染宿主广，感染后临床症状以腹泻为主，并对畜牧业与养殖业造成巨大的经济损失。微小隐孢子虫（C.parvum）为体积微小的人兽共患性寄生虫，广泛存在多种脊椎动物体内，寄生于人和大多数哺乳动物，引起的疾病为隐孢子虫病，主要以腹泻为主，严重时可危及生命。十二指肠贾第虫是重要的人兽共患性寄生虫，寄生于人体的胆囊和小肠，主要寄生于十二指肠，引起的疾病为贾第虫病，临床表现主要为腹痛、腹泻、腹胀、呕吐、发热和厌食等。微小隐孢子虫与十二指肠贾第虫的感染多因水源被其卵囊污染继而引发感染，且其感染的共同症状主要为腹泻，同样均为艾滋病检查的而重要指标之一，所以对微小隐孢子虫与十二指肠贾第虫的检测在公共安全方面尤为重要。羊作为重要的实验用动物目前并没有有效的药物用于治疗隐孢子虫病和贾第虫病，所以预防这两种寄生虫病的发生尤为重要。因此，羊缺乏一种准确率高，操作方便简单、特异性强、灵敏度好、周期短可用于大规模样品检测贾第虫与隐孢子虫的诊断方法，目前对微小隐孢子虫与十二指肠贾第虫的检测方法有镜检、IFA（免疫荧光检测法）、体外细胞感染、原位杂交技术、RT-PCR技术等，目前这些检测技术存在费时、费力、不准确、敏感性低、特异性差、不能满足检测轻度感染宿主粪便的要求。本实验建立实验羊贾第虫与隐孢子虫双重PCR方法恰恰满足这些要求。
技术实现思路
本专利技术提供一种羊贾第虫与隐孢子虫双重PCR检测试剂盒及其方法，可用于羊十二指肠贾第虫与微小隐孢子虫的快速检测。本专利技术进一步提供了上述试剂盒的制备方法。本专利技术羊十二指肠贾第虫、微小隐孢子虫双重PCR检测试剂盒的组成材料：（1）PCR反应液：2.5mMdNTPs，终浓度为10pmol/μL的上游引物和下游引物，10×PCRbuffer，rTaqDNA聚合酶，DNA模板和ddH2O。除DNA模板外，其他试剂可配制为Mix液冻存于-20℃长期存放；（2）双重PCR引物(均15pM)：十二指肠贾第虫PCR引物：F1：5'-CGACCTGACTATGACCAACTC-3'；R1：5'-GTCCTGAAGCATCTCAACACT-3'；微小隐孢子虫PCR引物：F2：5'-CCTTACTCCTTCAGCACCTTATG-3'；R2：5'-TGTTACGACTTCTCCTTCCTCTAA-3'；（3）阳性对照：阳性对照的粪便基因组DNA模板为十二指肠贾第虫与微小隐孢子虫基因组DNA，用于比较双重PCR产物以及监测双重PCR操作过程是否正确；（4）阴性对照：阴性对照的模板为灭菌ddH2O，目的在排除反应液中的核酸污染和操作过程中的假阳性问题。本专利技术的试剂盒还含有琼脂糖（Agarose）、溴酚蓝点样缓冲液和溴化乙锭(E.B)10μg/μl及PCR反应管。本专利技术所述的羊十二指肠贾第虫与微小隐孢子虫检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：1）双重PCR引物(均15pM)：十二指肠贾第虫PCR引物：F1：5'-CGACCTGACTATGACCAACTC-3'；R1：5'-GTCCTGAAGCATCTCAACACT-3'；微小隐孢子虫PCR引物：F2：5'-CCTTACTCCTTCAGCACCTTATG-3'；R2：5'-TGTTACGACTTCTCCTTCCTCTAA-3'；2）粪便基因组DNA的提取：使用生物公司出售的粪便基因组DNA提取试剂盒，提取羊粪便中的十二指肠贾第虫与微小隐孢子虫基因组DNA；3）PCR扩增：（1）准备待检样品的PCR反应管并分别标记，管内加入PCR反应液，然后加入引物、基因组DNA模板和rTaqPolymerase(5U/μl)，涡旋混匀后瞬时离心后，放入PCR仪中，设置PCR反应条件；（2）PCR反应条件为：94℃预变性3min、94℃变性30s、57℃退火30s、72℃延伸30s，共33个循环，后72℃延伸10min；4）PCR产物观察：配制1.0%琼脂糖凝胶（加入浓度0.5μg/mL的E.B），加样后120V-145V电压下电泳18-25min，之后在紫外灯或凝胶成像系统下观察实验结果，若样品在447bp（十二指肠贾第虫）、700bp（微小隐孢子虫）大小处存在条带就证明该样品为阳性。本专利技术的积极效果在于：根据十二指肠贾第虫TPI基因、微小隐孢子虫18SrRNA基因部分保守序列设计引物，建立双重PCR检测方法，并且通过优化PCR反应的退火温度等反应条件来提高其灵敏性和准确性，扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后观察结果方便、快捷。不同目的片段的区分是双重PCR检测方法建立的关键之一，本专利技术扩增的两种目的片段在琼脂糖凝胶电泳中大小差异显著，易于区分，且敏感性可达到5×102/g粪便，高于两种寄生虫已报导的镜检法与常规PCR检测方法，适合于临床实践中样本的检测。本专利技术检测方法可以同时快速检测羊的十二指肠贾第虫与微小隐孢子虫，具有操作简单、灵敏度高、特异性强等特点。同时为实验用实羊的质量标准提供技术支持。附图说明附图1：双重PCR退火温度的优化图；附图2：双重PCR特异性试验图；附图3：双重PCR灵敏度试验图；附图4~图5：双重PCR实际应用图。具体实施方式下列实施例旨在进一步举例说明，而不是限制本专利技术。本领域技术人员可以理解到，在不背离本专利技术的精神和原则的前提下，对本专利技术的任何平行改变和改动都将落入本专利技术的待批权利要求范围内。实施例1十二指肠贾第虫与微小隐孢子虫特异基因选择十二指肠贾第虫与微小隐孢子虫虫种特异诊断序列：选择具有高度保守性的TPI基因与18SrRNA基因序列，NCBI中比对其为贾第虫与隐孢子虫所特有，符合种特异检测研究标准；双重PCR检测试剂盒的引物设计用生物软件设计特异性诊断引物如下：十二指肠贾第虫PCR引物：F1：5'-CGACCTGACTATGACCAACTC-3'；R1：5'-GTCCTGAAGCATCTCAACACT-3'；微小隐孢子虫PCR引物：F2：5'-CCTTACTCCTTCAGCACCTTATG-3'；R2：5'-TGTTACGACTTCTCCTTCCTCTAA-3'；双重PCR检测试剂盒的组成（1）PCR反应液：2.5mMdNTPs，终浓度为10pmol/μL的上游引物和下游引物，10×PCRbuffer，rTaqDNA聚合酶，DNA模板和ddH2O。除DNA模板外，其他试剂可配制为Mix液冻存于-20℃长期存放；（2）引物：十二指肠贾第虫上游引物（F1）和十二指肠贾第虫下游引物（R1）、微小隐孢子虫上游引物（F2）和微小隐孢子虫下游引物（R2）；（3）阳性对照：阳性对照的粪便基因组DNA模板为十二指肠贾第虫、微小隐孢子虫基因组DNA，用于比较PCR产物以及监测PCR操作过程是否正确；（4）阴性对照：阴性对照的模板为灭菌ddH2O，目的在排除反应液中的核酸污染和操作过程中的假阳性问题。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于扩增羊十二指肠贾第虫与微小隐孢子虫双重PCR的nest‑PCR扩增引物，具有以下序列：十二指肠贾第虫PCR引物：F1 ：5'‑CGACCTGACTATGACCAACTC‑3'；R1 ：5'‑GTCCTGAAGCATCTCAACACT‑3'；微小隐孢子虫PCR引物：F2：5'‑CCTTACTCCTTCAGCACCTTATG‑3'；R2 ：5'‑TGTTACGACTTCTCCTTCCTCTAA‑3'；所述的羊十二指肠贾第虫特异基因序列如SEQ No.1所示；所述的羊微小隐孢子虫特异基因序列如SEQ No.4所示。

【技术特征摘要】
1.用于扩增羊十二指肠贾第虫与微小隐孢子虫双重PCR的nest-PCR扩增引物，具有以下序列：十二指肠贾第虫PCR引物：F1：5'-CGACCTGACTATGACCAACTC-3'；R1：5'-GTCCTGAAGCATCTCAACACT-3'；微小隐孢子虫PCR引物：F2：5'-CCTTACTCCTTCAGCACCTTATG-3'；R2：5'-TGTTACGACTTCTCCTTCCTCTAA-3'；所述的羊十二指肠贾第虫特异基因序列如SEQNo.1所示；所述的羊微小隐孢子虫特异基因序列如SEQNo.4所示。2.一种羊十二指肠贾第虫、微小隐孢子虫双重PCR检测试剂盒，其特征在于：（1）在同一体系中制备羊十二指肠贾第虫、微小隐孢子虫的PCR反应液：2.5mMdNTPs，终浓度为10pmol/μL的上游引物和下游引物，10×PCRbuffer，rTaqDNA聚合酶，DNA模板和ddH2O；（2）双重PCR引物：十二指肠贾第虫PCR引物：F1：5'-CGACCTGACTATGACCAACTC-3'；R1：5'-GTCCTGAAGCATCTCAACACT-3'；微小隐孢子虫PCR引物：F2：5'-CCTTACTCCTTCAGCACCTTATG-3'；R2：5'-TGTTACGACTTCTCCTTCC...

【专利技术属性】
技术研发人员：宫鹏涛，张西臣，高宇航，李显赫，任文陟，李建华，杨举，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林,22