一种CelB基因的用途制造技术

本发明专利技术提供了一种CelB基因的用途，所述基因的Genbank登陆号为CP003785.1，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；本发明专利技术通过多重BLAST筛选分析发现基因名为CelB的肺炎克雷伯氏菌特异性基因，针对该基因设计内外游引物，构建了两种鉴定体系，优化了反应体系及流程，并进行灵敏度和特异性实验，证明该基因能有效鉴定或检测肺炎克雷伯氏菌，灵敏度高，特异性好，操作简便，具有广阔的应用前景和市场价值。

【技术实现步骤摘要】
一种CelB基因的用途
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种CelB基因的用途。
技术介绍
肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumonia，K.pneumonia)，属于肠杆菌科克雷伯氏菌属，革兰氏染色阴性，无鞭毛和芽孢，但有明显的荚膜和菌毛，绝大多数K.pneumonia还具有菌毛抗原、菌体抗原、荚膜抗原等多种主要抗原成分，其为兼性厌氧菌，对营养需求低，一般的LB平板培养基上过夜培养即可形成凸起、较大、灰白色的粘液型菌落，最适生长温度为37℃，肺炎克雷伯氏菌对人致病性较强，是重要的条件致病菌和医源性感染菌之一，在健康人的呼吸道和肠道正常菌丛中、自然界水和谷物中均能分离到克雷伯氏菌，外界环境中存在的肺炎克雷伯氏菌对免疫低下人群具有较大的健康威胁，受到肺炎克雷伯氏菌污染的食物与正常食物在外形与味觉上没有区别，因此准确、快速地检测肺炎克雷伯氏菌具有十分重要的意义。CN101892300A提供一种肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒，所述的肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒包括以肺炎克雷伯氏菌的oppA基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的两对引物：内引物FIP/BIP和外引物F3/B3。CN103642910A采用基因克隆技术，将肺炎克雷伯氏菌RecA基因片段插入到载体pMD18-T中，获得含有RecA基因片段的重组质粒，以此作为标准品，根据肺炎克雷伯氏菌RecA基因片段设计并合成一组特异性引物和探针，优化PCR反应条件，建立以实时荧光定量聚合酶链反应为平台的检测方法，并对所建立的方法进行有效性评估试验，但上述现有技术实验步骤繁琐，检测基因特异性差，周期漫长，准确度不高。作为最常见的条件致病菌之一，肺炎克雷伯菌在环境中的存在情况也是值得重视的课题，目前常用的检测肺炎克雷伯氏菌的检测方法主要包括细菌分离鉴定、免疫学方法、分子生物学检测方法等，但这些方法都存在一些缺陷。传统的检测方法主要采用细菌前增菌培养、分离培养、菌落形态观察和一系列的生化鉴定以及血清型鉴定等步骤，一般需4至7天，操作繁琐，费时耗力；免疫学方法易污染，且交叉反应比较严重、假阳性多、灵敏度偏低；随着分子生物学和生物信息学的发展，陆续发现了一些病原菌保守的核酸序列，在此基础上建立了众多的检测技术，其中主要有核酸探针检测技术、实时荧光PCR检测技术、LAMP和PCR技术，这些方法因其特异性强、灵敏度高、省时等特点已越来越多的被应用于微生物鉴定中，但是这些方法用于对自然环境尤其是医院环境的检测和监测罕见报道。因此，研发一种特异性良好、灵敏度较好、检测快速可靠、操作简单的肺炎克雷伯氏菌的鉴定体系对于提供公共环境的卫生水平具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。
技术实现思路
针对现有技术的不足及实际的需求，本专利技术提供一种CelB基因的用途，本专利技术通过多重BLAST筛选分析发现基因名为CelB的肺炎克雷伯氏菌特异性基因，针对该基因设计内外游引物，构建了两种鉴定体系，并进行灵敏度和特异性实验，证明该基因能有效鉴定或检测肺炎克雷伯氏菌，灵敏度高，特异性好，操作简便，具有广阔的应用前景和市场价值。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供一种CelB基因用于鉴定肺炎克雷伯氏菌的用途，所述基因的Genbank登陆号为CP003785.1，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示：SEQIDNO.1:ATGCAAAGCATTGGTCAAAATACCTACCTTAAGTCAATCATGAGCGGTATGATGCTCATATTGCCAGTAACGATCATGAGTTCTGTGGCGACTTTGGTTAAAGTGTTTCCGTTTGCTCCATATCAGGATTTTTTGTTACGACACAACTTAACTCGCTTCTTTGATATCCCGATTACCTTCACGAATAATTTTTTGGCCGTGATTGTCGCTTTCTCCGTTGCCTATACGCTAGCGAAAAATTTCGATGTTGATGGCTTCATGTCAGGCCTGATTTCAATGATCTCTTTCTTTATTTTAACGCCGTATGATCTCGGTGAAATAGGGCCGTTAGCTCTTTGA.在本专利技术中，专利技术人通过生物信息学手段，经由基于基因组的本地BLAST及筛选，并进行在线BLAST分析重确认而获得用于鉴定肺炎克雷伯氏菌的基因，该基因为cellobiose-specificPTSfamilyenzymeIICcomponent，基因名CelB，Genbank登陆号为CP003785.1(2559834..2560172)，发现该基因为肺炎克雷伯氏菌特有，且可以用于检测和鉴定克雷伯氏菌。第二方面，本专利技术提供一种鉴定肺炎克雷伯氏菌的引物，根据第一方面所述的基因进行设计，所述引物包括一对外游引物和一对内游引物；所述外游引物为B3和F3，所述内游引物为BIP和FIP。其中，所述外游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2-3所示，所述内游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.4-5所示。外游引物B3(SEQIDNO.2):TCATGAGCGGTATGATGC；外游引物F3(SEQIDNO.3):CGGAGAAAGCGACAATCA；内游引物BIP(SEQIDNO.4):CTGATATGGAGCAAACGGAAACACTTTTGCCAGTAACGATCATGAGT；内游引物FIP(SEQIDNO.5):TTGTTACGACACAACTTAACTCGCTTTTCCAAAAAATTATTCGTGAAGGT.本专利技术中，专利技术人以基因cellobiose-specificPTSfamilyenzymeIICcomponent，基因名CelB，Genbank登陆号为CP003785.1(2559834..2560172)设计特异引物，包括一对外游引物和一对内游引物，该引物用于LAMP技术检测，其中外游引物还用作PCR反应的上、下游引物，用于肺炎克雷伯氏菌的鉴定。第三方面，本专利技术提供一种鉴定肺炎克雷伯氏菌的方法，包括如下步骤：(1)针对基因CelB设计特异性引物，包括一对外游引物和一对内游引物；(2)采集样本并进行增菌培养，提取DNA，得到待测模板；(3)建立PCR鉴定体系和/或LAMP鉴定体系，对待测模板进行检测。优选地，在步骤(1)之前还包括BLAST筛选步骤。优选地，所述BLAST筛选包括本地BLAST和在线BLAST。优选地，所述本地BLAST的步骤包括：从NCBI下载非冗余核酸数据库并构建靶数据库，将肺炎克雷伯氏菌全基因组序列作为检索数据，与靶数据库进行比对筛选，得到潜在特异序列。优选地，所述在线BLAST的步骤包括：BLAST时排除肺炎克雷伯菌，相似序列覆盖度小于30％或无相似序列，且BLAST时选择肺炎克雷伯菌，得到目的菌种的不同菌株共有序列的大量相似序列，该相似序列即为特异性靶基因；优选地，步骤(1)所述外游引物用作PCR鉴定体系。优选地，步骤(3)所述PCR鉴定体系的反应体系为：10-15μL2×PCR预混液，8-12μM的外游引物，40-60ng待测样品DNA。优选地，所述预混液包含1-3UDNA聚合酶、1-3mMMgCl2和180-220μMdNTP。优选地，所述预混液的体积为1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种CelB基因用于鉴定肺炎克雷伯氏菌的用途。

【技术特征摘要】
1.一种CelB基因用于鉴定肺炎克雷伯氏菌的用途。2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述基因的Genbank登陆号为CP003785.1，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。3.一种鉴定肺炎克雷伯氏菌的引物，其特征在于，根据权利要求1或2所述的基因进行设计，所述引物包括一对外游引物和一对内游引物；其中，所述外游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2-3所示，所述内游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.4-5所示。4.一种鉴定肺炎克雷伯氏菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)针对基因CelB设计特异性引物，包括一对外游引物和一对内游引物；(2)采集样本并进行增菌培养，提取DNA，得到待测模板；(3)建立PCR鉴定体系和/或LAMP鉴定体系，对待测模板进行检测。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤(1)之前还包括BLAST筛选步骤；优选地，所述BLAST筛选包括本地BLAST和在线BLAST；优选地，所述本地BLAST的步骤包括：从NCBI下载非冗余核酸数据库并构建靶数据库，将肺炎克雷伯氏菌全基因组序列作为检索数据，与靶数据库进行比对筛选，得到潜在特异序列；优选地，所述在线BLAST的步骤包括：BLAST时排除肺炎克雷伯菌，相似序列覆盖度小于30％或无相似序列，且BLAST时选择肺炎...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏雪山，宋玉竹，杨光英，
申请(专利权)人：云南科耀生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：云南,53