一种检测产2-甲基异莰醇菌株的标准品及制备、检测方法技术

技术编号:19448208 阅读:63 留言:0更新日期:2018-11-14 17:12
本发明专利技术公开了一种检测产2‑甲基异莰醇菌株的标准品及制备、检测方法,所述检测方法包括如下步骤:步骤一,以重组质粒为标准品模板,用实时定量PCR进行PCR扩增,建立标准品的浓度与临界循环数对应的标准曲线;步骤二,用待测样品替换步骤一中的标准品,进行实时定量PCR扩增,根据扩增结果的临界循环数和标准曲线,得到待测样品中pgmtc基因的拷贝数,即得到所述待测样品中产2‑甲基异莰醇菌株的数量,通过本发明专利技术,可实现水环境样品中产2‑MIB菌株的快速定量检测。

【技术实现步骤摘要】
一种检测产2-甲基异莰醇菌株的标准品及制备、检测方法
本专利技术涉及分子生物学领域,特别是涉及一种检测产2-甲基异莰醇菌株的标准品及制备、检测方法。
技术介绍
全球范围内都曾发生过水体嗅味问题。2-甲基异莰醇(2-MIB)是水中常见的嗅味物质,主要由放线菌、真菌和蓝绿藻代谢产生,其嗅阈值极低,在很低的浓度水平下即可感知到异味的存在(10ng/L)。2-MIB引起的嗅味问题对社会的影响是多方面的,会影响饮用水的饮用口感,降低饮用水和水产品的品质,引发饮用者厌恶、恶心等不愉快心理,同时也降低了湖泊水库的水环境美学价值。尽管没有研究直接指出,微生物产生的2-MIB对人体健康有何危害,但由于其特殊的气味,一旦水体出现嗅味问题,就会引起广大居民的投诉和关注。众所周知,蓝藻水华时可产生2-甲基异莰醇,此过程在几天内就可迅速完成,因此,这就需要水质监测部门能够快速检测2-甲基异莰醇。常规条件下可通过人的感官、气相色谱和质谱联用法测定嗅味物质的含量。但这些方法都要耗费大量的时间、精力,错过了嗅味物质风险预警分析的最佳时机。因此,建立高灵敏度、高特异性的检测方法迫在眉睫。
技术实现思路
为克服上述现有技术存在的不足,本专利技术之目的在于提供一种检测产2-甲基异莰醇菌株的标准品及制备、检测方法,以实现水环境样品中产2-MIB菌株的快速定量检测。为达上述及其它目的,本专利技术提出一种检测产2-甲基异莰醇菌株的标准品,所述标准品为包含pgmtc基因的重组质粒或重组细胞,所述pgmtc基因的序列为序列表SEQIDNO.1中的序列。优选地,所述重组质粒中的出发质粒是pMD-18T。为达到上述目的,本专利技术还提供一种上述标准品的制备方法,包括如下步骤:步骤一,针对pgmtc基因设计特异性的引物;步骤二,取地表水水样,利用DNA提取试剂盒进行总DNA提取纯化,得到DNA样本;步骤三,以步骤二中的DNA样本为模板进行PCR扩增;步骤四,对PCR扩增产物进行纯化;步骤五,将纯化后的PCR扩增产物与质粒载体pMD18-T链接,获得转化了质粒的白色菌落;步骤六,选取饱满的单菌落接种于培养液中培养过夜,并利用质粒提取试剂盒提取质粒,获得大量的质粒标准品,以用于菌液PCR鉴定和测序分析。优选地,于步骤一中,下载pgmtc基因序列进行同源性比较分析,设计和合成特异性的引物,所述PCR产物长度为223bp,引物序列如下:上游引物为SEQIDNO.2,下游引物为SEQIDNO.3。优选地,于步骤三中,采用反应体系为50μL,引物信息为:上游引物为SEQIDNO.2,下游引物为SEQIDNO.2,反应程序为:95℃预变性5分钟,随后95℃15秒,退火温度60℃45秒和72℃延伸40秒,进行45个循环,最终72℃延伸10分钟,并通过1.5%(wt/vol)的琼脂糖凝胶电泳确认产物。为达到上述目的,本专利技术还提供一种检测产2-甲基异莰醇菌株的方法,包括如下步骤:步骤一,以重组质粒为标准品模板,用实时定量PCR进行PCR扩增,建立标准品的浓度与临界循环数对应的标准曲线;步骤二,用待测样品替换步骤一中的标准品,进行实时定量PCR扩增,根据扩增结果的临界循环数和标准曲线,得到待测样品中pgmtc基因的拷贝数,即得到所述待测样品中产2-甲基异莰醇菌株的数量。优选地,所述实时定量PCR扩增的体系包括实时定量PCR扩增缓冲液、引物对和模板,所述引物对包括:上游引物为SEQIDNO.2下游引物为SEQIDNO.3,所述上下游引物在反应体系中的浓度均为0.1~0.3μM/L。优选地,于步骤一中,将质粒标准品进行若干倍梯度稀释,作为定量PCR模板DNA,进行实时定量PCR扩增,按照试剂盒说明进行操作,加入实时定量PCR所需试剂,PCR反应体系为20μL,加入2μL质粒标准品作为反应模板,进行实时定量PCR反应,采用两步法进行PCR扩增,反应条件为:预变性,1个循环,95℃15秒;PCR反应,45个循环,95℃5秒,60℃45秒,以去离子水作为阴性对照,以标准品稀释梯度的对数值为横坐标,以临界循环数为纵坐标建立实时定量PCR的标准曲线。优选地,所述标准品模板在所述实时定量PCR扩增的体系中的浓度为5.79×102copies/μL、5.79×103copies/μL、5.79×104copies/μL、5.79×105copies/μL、5.79×106copies/μL和5.79×107copies/μL中之一。优选地,于步骤二中,取地表水水样,利用DNA提取试剂盒进行总DNA提取纯化,得到DNA样本作为待测样品,用待测样品替换步骤一中的标准品,进行实时定量PCR扩增,按照试剂盒说明进行操作,加入实时定量PCR所需试剂,反应体系为20μL,2μLDNA样品,设立阴性对照和阳性对照,进行实时定量PCR反应,采用两步法进行PCR扩增,反应条件为:预变性,1个循环,95℃15秒;PCR反应,45个循环,95℃5秒,60℃45秒。与现有技术相比,本专利技术一种检测产2-甲基异莰醇菌株的标准品及制备、检测方法通过提供一种检测样品中产2-甲基异莰醇菌株的标准品,并利用该标准品实现了快速定量检测地表水中产2-甲基异莰醇菌株的目的,由于该检测产2-甲基异莰醇菌株的标准品具有光谱识别和特异性相结合的特点,敏感性高,制备方法简便,可以长期保存,纯度好,线性检测范围宽,可以快速定量检测地表水中产2-甲基异莰醇菌株。附图说明图1为本专利技术第二实施例一种检测产2-甲基异莰醇菌株的标准品的制备方法的步骤流程图;图2为本专利技术第三实施例一种检测产2-甲基异莰醇菌株的方法的步骤流程图;图3为本专利技术具体实施例中定量PCR标准品的扩增曲线图4为本专利技术具体实施例中标准品的溶解曲线图5为本专利技术具体实施例中样品的溶解曲线。具体实施方式以下通过特定的具体实例并结合附图说明本专利技术的实施方式,本领域技术人员可由本说明书所揭示的内容轻易地了解本专利技术的其它优点与功效。本专利技术亦可通过其它不同的具体实例加以施行或应用,本说明书中的各项细节亦可基于不同观点与应用,在不背离本专利技术的精神下进行各种修饰与变更。2-MIB是一种甲基化的单萜醇,由甲羟戊酸或2C-甲基-4D-磷酸-赤藓糖醇(MEP)合成途径产生二甲丙烯焦磷酸(DMAPP)和异戊烯焦磷酸(IPP),DMAPP和IPP在镁离子的催化下经由GPP合成酶催化生成GPP,GPP在甲基转移酶(GPPMT)的催化下形成2-甲基GPP,在镁离子的催化下由单贴环化酶(MIBS)合成2-MIB,pgmtc基因编码MIBS。在放线菌和蓝藻合成2-甲基异莰醇的相关操纵子中均有pgmtc基因,并且在不同菌株中具有很高的同源性。pgmtc基因与2-MIB合成密切相关,因此可以通过检测pgmtc基因的拷贝数来检测产2-MIB菌株浓度。在本专利技术第一实施例中,本专利技术一种检测产2-甲基异莰醇菌株的标准品为含有pgmtc基因的重组质粒或重组细胞;所述pgmtc基因的序列是序列表SEQIDNO.1中的序列,所述重组质粒中的出发质粒是pMD-18T。图1为本专利技术第二实施例一种检测产2-甲基异莰醇菌株的标准品的制备方法的步骤流程图。如图1所示,本专利技术检测产2-甲基异莰醇菌株的标准品的制备方法,包括如下步骤:步骤101,针对pgmt本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测产2‑甲基异莰醇菌株的标准品,其特征在于:所述标准品为包含pgmtc基因的重组质粒或重组细胞,所述pgmtc基因的序列为序列表SEQ IDNO.1中的序列。

【技术特征摘要】
1.一种检测产2-甲基异莰醇菌株的标准品,其特征在于:所述标准品为包含pgmtc基因的重组质粒或重组细胞,所述pgmtc基因的序列为序列表SEQIDNO.1中的序列。2.如权利要求1所述的一种检测产2-甲基异莰醇菌株的标准品,其特征在于:所述重组质粒中的出发质粒是pMD-18T。3.一种如权利要求1所述的标准品的制备方法,包括如下步骤:步骤一,针对pgmtc基因设计特异性的引物;步骤二,取地表水水样,利用DNA提取试剂盒进行总DNA提取纯化,得到DNA样本;步骤三,以步骤二中的DNA样本为模板进行PCR扩增;步骤四,对PCR扩增产物进行纯化;步骤五,将纯化后的PCR扩增产物与质粒载体pMD18-T链接,获得转化了质粒的白色菌落;步骤六,选取饱满的单菌落接种于培养液中培养过夜,并利用质粒提取试剂盒提取质粒,获得大量的质粒标准品,以用于菌液PCR鉴定和测序分析。4.如权利要求3所述的标准品的制备方法,其特征在于:于步骤一中,下载pgmtc基因序列进行同源性比较分析,设计和合成特异性的引物,所述PCR产物长度为223bp,引物序列如下:上游引物为SEQIDNO.2,下游引物为SEQIDNO.3。5.如权利要求3所述的标准品的制备方法,其特征在于:于步骤三中,采用反应体系为50μL,引物信息为:上游引物为SEQIDNO.2,下游引物为SEQIDNO.2,反应程序为:95℃预变性5分钟,随后95℃15秒,退火温度60℃45秒和72℃延伸40秒,进行45个循环,最终72℃延伸10分钟,并通过1.5%(wt/vol)的琼脂糖凝胶电泳确认产物。6.一种检测产2-甲基异莰醇菌株的方法,包括如下步骤:步骤一,以重组质粒为标准品模板,用实时定量PCR进行PCR扩增,建立标准品的浓度与临界循环数对应的标准曲线;步骤二,用待测样品替换步骤一中的标准品,进行实时定量PCR扩增,根据扩增结果的临界循环数和标准曲线,得到待测样品中pgmtc基因的拷贝数,即得到所述待测...

【专利技术属性】
技术研发人员:陈蕾姜蕾
申请(专利权)人:上海城市水资源开发利用国家工程中心有限公司
类型:发明
国别省市:上海,31

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