不使用转基因标记序列分离细胞的方法技术

技术编号:19448207 阅读:36 留言:0更新日期:2018-11-14 17:12
本发明专利技术涉及用于在植物、植物细胞或材料中进行靶向编辑的方法,其与表型上可选择的性状的平行导入相组合。此外,提供的方法不包括引入转基因选择标记序列的步骤。

【技术实现步骤摘要】
不使用转基因标记序列分离细胞的方法
本专利技术涉及用于在植物、植物细胞或材料中进行靶向编辑的方法,其与表型上可选择的性状的平行导入相组合。此外,提供的方法不包括引入转基因选择标记序列的步骤。所述方法包括在第一基因组靶位点引入靶向修饰以获得可选择的表型,其不依赖于提供外源多核苷酸模板的,其也不依赖于在靶位点引入双链体断裂。最后,本专利技术涉及平行进行无转基因标记的选择和在不同基因组靶位点处进行靶向编辑的特定方法步骤的组合,从而赋予可选择的或其他表型以使得能够在没有选择标记盒的情况下分离植物材料以允许精准育种,显著减少用于鉴定感兴趣基因型的选择工作。专利技术背景精准修饰真核细胞的遗传信息对于农业、医药和医疗应用具有很高的价值,但对于基础研究来说也是相当重要的。基因组工程改造或编辑描述了以高精度在靶中进行这些明确的遗传变化的能力。真核细胞中的靶向性双链断裂可以例如由位点特异性核酸酶(SSN)或重组酶产生。在植物中,精确双链断裂诱导将同源重组(HR)事件的频率增加100倍至1000倍(Puchta等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:5055-5060,1996)。然而,经修饰的细胞和植物的下游鉴定限制了基因编辑作为植物改良的育种工具的常规实施。农业化学品等农业技术中植物育种和发展一个多世纪以来已经在提高作物产量方面取得了显著进展。但是,植物育种者必须不断应对许多变化。农业实践发生变化,这就需要开发具有携带特定农艺学特性的基因型的植物。此外,目标环境及其内部的生物体在不断变化。例如,真菌和昆虫害虫持续进化并克服感兴趣的植物的抗性。新的土地区域经常用于农业,使植物暴露于改变的生长条件。最后,消费者的喜好和要求改变。因此,植物育种者面临持续开发新作物品种的无尽任务(Collard和Mackill,Philos.Trans.R.Soc.Lond.Biol.Sci.2008Feb12;363(1491):557-572)。为了帮助育种策略,需要选择性标记序列或标记辅助选择(MAS)策略具有诊断潜力,从而可以可靠地确定感兴趣的基因型。如在EP2342337B1中所公开的,诊断标记的开发遵循一个过程,从定位反映靶性状的基因的遗传位置开始,鉴定侧翼标记,通过鉴定紧密连锁标记精细定位基因,确定最连锁标记的DNA标记序列,确定用于定位靶基因的亲本系之间标记基因座的序列变异,开发简单PCR测定,植物材料的遗传背景(种质)中的预测值测试,其中在筛选或育种期间将测试具有诊断性质的标记。所述策略毫无疑问费力且因此成本高昂,因为感兴趣的标记必须存在或必须插入感兴趣基因组内的合适位置。DNA标记技术可以通过基于易于测定的标记进行选择而不是确定表型特征来显著提高植物育种的效率。然而,具有诊断或筛选特性的这种标记的开发以及应用这些标记的有效性通常是如上所述的费力且耗时的过程。目前,用于检测点突变例如SNP的方法只能鉴定有限数量的这种点突变并检测有限的库(Slade等,Nat.Biotech.23,75-81)。尽管如此,选择性标记基因在植物中起着重要作用,用于转基因和转质体(transplastomic)植物研究或作物开发。选择性标记基因通常与报告基因组合使用,报告基因不向细胞提供可选择的优势,但报告基因可用于监测转基因事件,或人工从未转化材料分离转基因材料。一个快速发展的领域是开发消除选择性标记基因以产生无标记植物的策略。一些评论(Yoder和Goldsbrough,1994;Ow,2001;HareandChua,2002)详细讨论了创建无标记植物的合理化。对于转基因和非转基因植物的商业化,它将简化监管过程并提高消费者的接受度,去除在最终植物品种中没有用途的基因序列。从最终植物消除标记基因将允许使用未经过广泛的生物安全评估或可能在植物中产生负多效作用的实验标记基因。此外,如果它们在下一轮转化之前被消除,将允许回收有用的标记基因以用于转基因植物的重复转化。因此转基因选择标记基因可以增加回收从处理的细胞中再生的植物的效率,但是将转基因测序引入植物基因组并不总是期望的。此外,已经实现的转基因标记基因在选择后的消除往往非常复杂。在过去几年中,精准的基因编辑或基因组工程改造已经发展成为遗传工程最重要的领域之一,可以对目标基因组进行靶向和定点操纵。定点基因组工程改造的一个必不可少的先决条件是可编程的核酸酶,它可以用来在指定的位置断裂感兴趣的核酸以诱导双链断裂(DSB)或一个或多个单链断裂。或者,所述核酸酶可以是嵌合或突变的变体,不再包含核酸酶功能,而是作为识别分子与另一种酶组合。因此那些核酸酶或其变体对于任何基因编辑或基因组工程改造方法都是关键的。近年来,已经开发了许多合适的核酸酶,特别是定制的内切核酸酶,包括大范围核酸酶,锌指核酸酶,TALE核酸酶,衍生自例如格氏黄杆菌(Natronobacteriumgregoryi)的Argonaute核酸酶和作为成簇的规律间隔短回文重复(CRISPR)系统的一部分的CRISPR核酸酶,包括例如Cas,Cpf1,CasX或CasY核酸酶。在其自然环境中的CRISPRs(成簇的规律间隔短回文重复)最初在细菌中进化,其中CRISPR系统履行适应性免疫系统的作用以防御病毒攻击。暴露于病毒后,病毒DNA的短片段被整合到CRISPR基因座中。从包含病毒序列的CRISPR基因座的一部分转录出RNA。该RNA含有与病毒基因组互补的序列,介导CRISPR效应蛋白靶向病毒基因组中的靶序列。CRISPR效应蛋白切割并从而干扰病毒靶的复制。在过去的几年中,CRISPR系统也已经成功地用于真核细胞中的基因编辑或基因组工程改造。目前,动物细胞的编辑和人类的治疗应用是重要的研究重点。对复杂动物和植物基因组进行有靶向修饰仍然是一项艰巨的任务。在其天然环境中的CRISPR系统描述了分子复合物,其包含至少一个小的和单独的非编码RNA,其与Cas核酸酶或另一种CRISPR核酸酶如Cpf1核酸酶组合(Zetscheetal.,"Cpf1IsaSingleRNA-GuidesEndonucleaseofaClass2CRISPR-CasSystem",Cell,163,pp.1-13,October2015),其可以产生特定的DNA双链断裂。目前,CRISPR系统分为两类,包括五种类型CRISPR系统,II型系统,例如使用Cas9作为效应物,和V型系统,其使用Cpf1作为效应分子(Makarova等,NatureRev.Microbial.,2015年)。在人工CRISPR系统中,合成的非编码RNA和CRISPR核酸酶和/或任选地修饰的CRISPR核酸酶(修饰用作切口酶或缺乏任何核酸酶功能)可以与至少一种合成的或人工向导RNA或组合crRNA和/或tracrRNA功能的gRNA组合使用(Makarova等,2015,同上)。由CRISPR/Cas在天然系统中介导的免疫应答需要CRISPR-RNA(crRNA),其中控制CRISPR核酸酶的特异性激活的该向导RNA的成熟在至今已表征的各种CRISPR系统之间显著不同。首先,入侵DNA,也称为间隔区,整合在CRISPR基因座近端的两个相邻重复区域之间。II型CRISPR系统编码C本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于分离至少一个经修饰的植物细胞或包含所述至少一个经修饰的植物细胞的至少一个经修饰的植物组织、器官或完整植物,而没有稳定整合转基因可选择标记序列的方法实现上述目的,所述方法包括:(a)将至少一个第一靶向碱基修饰引入至少一个待修饰植物细胞的第一植物基因组靶位点中,其中所述至少一个靶向碱基修饰引起至少一种表型可选择的性状的表达;(b)将至少一个第二靶向修饰引入所述至少一个待修饰植物细胞的第二植物基因组靶位点中,其中使用至少一个位点特异性效应物在所述第二植物基因组靶位点处产生所述至少一个第二靶向修饰来引入所述至少一个第二靶向修饰,其中所述至少一个第二靶向修饰与所述至少一个第一靶向碱基修饰的引入同时地或在所述至少一个第一靶向碱基修饰的引入之后被引入至相同的至少一个待修饰植物细胞,或者被引入至其包含所述至少一个第一靶向修饰的至少一个后代细胞、组织、器官或植物,从而获得至少一个经修饰的植物细胞;和(c)分离至少一个经修饰的植物细胞、组织、器官或完整植物,或分离其至少一个后代细胞、组织、器官或植物,其通过选择(i)由在所述第一植物基因组靶位点处的所述至少一个第一靶向碱基修饰导致的至少一种表型可选择性状,并且任选地通过进一步选择(ii)所述第二植物基因组靶位点中的所述至少一个第二靶向修饰。...

【技术特征摘要】
2017.05.05 US 62/502,418;2017.09.01 CN 201710778191.一种用于分离至少一个经修饰的植物细胞或包含所述至少一个经修饰的植物细胞的至少一个经修饰的植物组织、器官或完整植物,而没有稳定整合转基因可选择标记序列的方法实现上述目的,所述方法包括:(a)将至少一个第一靶向碱基修饰引入至少一个待修饰植物细胞的第一植物基因组靶位点中,其中所述至少一个靶向碱基修饰引起至少一种表型可选择的性状的表达;(b)将至少一个第二靶向修饰引入所述至少一个待修饰植物细胞的第二植物基因组靶位点中,其中使用至少一个位点特异性效应物在所述第二植物基因组靶位点处产生所述至少一个第二靶向修饰来引入所述至少一个第二靶向修饰,其中所述至少一个第二靶向修饰与所述至少一个第一靶向碱基修饰的引入同时地或在所述至少一个第一靶向碱基修饰的引入之后被引入至相同的至少一个待修饰植物细胞,或者被引入至其包含所述至少一个第一靶向修饰的至少一个后代细胞、组织、器官或植物,从而获得至少一个经修饰的植物细胞;和(c)分离至少一个经修饰的植物细胞、组织、器官或完整植物,或分离其至少一个后代细胞、组织、器官或植物,其通过选择(i)由在所述第一植物基因组靶位点处的所述至少一个第一靶向碱基修饰导致的至少一种表型可选择性状,并且任选地通过进一步选择(ii)所述第二植物基因组靶位点中的所述至少一个第二靶向修饰。2.如权利要求1所述的方法,其中步骤(b)另外包括引入修复模板以在所述至少第二植物基因组靶位点进行靶向序列转换或置换。3.如权利要求1所述的方法,进一步的步骤(d)将包含所述至少一个第一和至少一个第二靶向修饰的至少一个经修饰的植物或植物材料与感兴趣的另外的植物或植物材料杂交以分离所产生的后代植物或植物材料以获得感兴趣的基因型,任选地其中感兴趣的基因型不包含所述至少一个第一靶向修饰。4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述至少一个位点特异性效应物暂时或永久地与至少一个碱基编辑复合物连接,其中所述碱基编辑复合物介导步骤(a)的至少一个第一靶向碱基修饰。5.根据权利要求1所述的方法,所述至少一个位点特异性效应物选自以下至少一种:核酸酶,其包含CRISPR核酸酶,包括Cas或Cpf1核酸酶,TALEN,ZFN,大范围核酸酶,Argonaute核酸酶,限制性内切核酸酶,包括FokI或其变体,重组酶,或两个位点特异性切口内切核酸酶,或碱基编辑器(baseeditor),或前述效应物的任何变体或催化活性片段。6.根据权利要求1所述的方法,所述至少一个位点特异性效应物是基于CRISPR的核酸酶,其中所述基于CRISPR的核酸酶包含指导所述至少一个碱基编辑复合物的位点特异性DNA结合结构域,其中所述至少一个基于CRISPR的核酸酶,或编码其的核酸序列,选自包含以下的组:(a)Cas9,包括SpCas9、SaCas9、SaKKH-Cas9、VQR-Cas9、St1Cas9,(b)Cpf1,包括AsCpf1、LbCpf1、FnCpf1,(c)CasX或(d)CasY,或前述基于CRISPR的核酸酶的任何变体或衍生物,优选其中所述至少一个基于CRISPR的核酸酶与相应的野生型序列相比包含突变,使得所获得的基于CRISPR的核酸酶转变为单链特异性DNA切口酶或缺乏全部DNA切割能力的DNA结合效应物。7.如权利要求1所述的方法,其特征在于,至少一个第一靶向碱基修饰由至少一个碱基编辑复合物产生,该碱基编辑复合物包括至少一个碱基编辑器作为组件。8.如权利要求7所述的方法,其中碱基编辑复合物包含至少一个胞苷脱氨酶或其催化活性片段。9.如权利要求7所述的方法,其中所述至少一个第一靶向碱基修饰是任意核苷酸C,A,T或G至任意其他核苷酸的转换。10.根据权利要求7所述的方法,其中所述碱基编辑复合物包含APOBEC1组件。11.如权利要求7所述的方法,其中所述碱基编辑复合物包含UGI组件,和/或所述碱基编辑复合物包含XTEN组件。12.如权利要求7所述的方法,其中所述碱基编辑复合物包含PmCDA1组件。13.如权利要求7所述的方法,其特征在于,所述至少一个碱基编辑复合物包括多于一个的组件,并且所述至少两个组件是物理连接的。14.根据权利要求7所述的方法,其中,所述至少一个碱基编辑复合物包括多于一个的组件,并且所述至少两个组件作为单独的组件提供。15.根据权利要求7所述的方法,其中所述至少一个碱基编辑复合物的至少一个组件包括至少一个细胞器定位信号以将所述至少一个碱基编辑复合物靶向亚细胞细胞器。16.根据权利要求15所述的方法,其中所述至少一个细胞器定位信号是核定位信号(NLS)。17.根据权利要求15所述的方法,其中所述至少一个细胞器定位信号是叶绿体转运肽。18.根据权利要求15所述的方法,其中所述至少一个细胞器定位信号是线粒体转运肽。19.根据权利要求1所述的方法,其中所述至少一个植物细胞的第一植物基因组靶位点是编码至少一种表型可选择性状的基因组靶位点,其中所述至少一种表型可选择性状是抗性/耐受性性状或生长优势性状,并且其中所述至少一个植物细胞的第一植物基因组靶位点处的所述至少一个第一靶向碱基修饰赋予针对添加至所述至少一个经修饰的植物细胞、组织或植物或其后代的化合物或触发剂的抗性/耐受性或生长优势。20.权利要求19的方法,其中所述至少一种表型可选择的感兴趣性状是至少一个内源基因或由至少一个内源基因编码,或所述至少一种感兴趣的表型性状是至少一个转基因或由至少一个转基因编码,其中所述至少一个内源基因或所述至少一个转基因编码至少一种表型性状,其选自对抑制、破坏或杀死在所述至少一种表型性状上缺乏所述至少一个修饰的细胞的植物毒素,优选除草剂的抗性/耐受性,或者其中所述至少一种表型性状选自增强的细胞分裂,生长速率,胚胎发生或另一种为经修饰的细胞、组织、器官或植物提供相对于未经修饰的细胞、组织、器官或植物的优势的表型可选择的特性。21.根据权利要求19所述的方法,其中所述至少一个第一植物基因组靶位点是编码至少一种选自除草剂抗性/耐受性的表型可选择性状的至少一个内源基因或转基因,其中除草剂抗性/耐受性选自包括对EPSPS抑制剂(包括草甘膦)的抗性/耐受性;对谷氨酰胺合成抑制剂包括草铵膦的抗性/耐受性;对ALS-或AHAS-抑制剂(包括咪唑啉或磺酰脲)的抗性/耐受性;对ACCase抑制剂(包括芳氧基苯氧基丙酸(FOP))的抗性/耐受性;对类胡萝卜素生物合成抑制剂的抗性/耐受性,包括八氢番茄红素去饱和酶步骤的类胡萝卜素生物合成抑制剂、4-羟基苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)抑制剂或其他类胡萝卜素生物合成靶抑制剂;对纤维素抑制剂的抗性/耐受性;对脂质合成抑制剂的抗性/耐受性;对长链脂肪酸抑制剂的抗性/耐受性;对微管组装抑制剂的抗性/耐受性;对光系统I电子分流剂的抗性/耐受性;对光系统II抑制剂(包括氨基甲酸酯、三嗪类和三嗪酮类)的抗性/耐受性;对PPO-抑制剂的抗性/耐受性和对合成生长素(包括麦草畏(2,4-D,即2,4-二氯苯氧乙酸))的抗性/耐受性。22.根据权利要求19所述的方法,其中所述至少一种表型可选择性状是植物毒性抗性/耐受性状,优选除草剂抗性/耐受性状,并且其中所述至少一个待修饰植物细胞的第一植物基因组靶位点处的至少一个第一靶向碱基修饰赋予对植物毒性化合物,优选除草剂的抗性/耐受性,所述化合物是待加入所述至少一个经修饰的植物细胞、组织、器官或完整植物或其后代的外源化合物。23.权利要求19的方法,其中所述至少一个植物细胞的第一植物基因组靶位点是ALS。24.权利要求19的方法,其中所述至少一个植物细胞的第一植物基因组靶位点是PPO。25.权利要求19的方法,其中所述至少一个植物细胞的所述第一植物基因组靶位点是EPSPS、ALS或PPO,并且其中并且其中所述EPSPS、ALS或PPO包含至少一个导致至少一个相应氨基酸转换的核酸转换,其中所述至少一个核酸转换是通过至少一个碱基编辑器进行的。26.根据权利要求23所述的方法,其中与根据SEQIDNO:25的ALS参考序列相比,编码A122的序列处发生了靶向修饰。27.根据权利要求23所述的方法,其中与根据SEQIDNO:25的ALS参考序列相比,在编码P197的序列处发生靶向修饰。28.根据权利要求23所述的方法,其中与编码SEQIDNO:25的ALS参考序列相比,在编码A205的序列处发生靶向修饰。29.根据权利要求23所述的方法,其中与根据SEQIDNO:25的ALS参考序列相比,在编码D376的序列处发生靶向修饰。30.根据权利要求23所述的方法,其中与编码SEQIDNO:25的ALS参考序列相比,编码R377的序列处发生靶向修饰。31.根据权利要求23所述的方法,其中与编码根据SEQIDNO:25的ALS参考序列相比,编码W574的序列处发生靶向修饰。32.根据权利要求23所述的方法,其中与编码SEQIDNO:25的ALS参考序列相比,编码S653的序列处发生靶向修饰。33.根据权利要求23所述的方法,其中与编码根据SEQIDNO:25的ALS参考序列相比,编码G654的序列处发生靶向修饰。34.根据权利要求24所述的方法,其中与编码SEQIDNO:26的PPO参考序列相比,编码C215的序列处发生靶向修饰。35.权利要求24的方法,其中与根据SEQIDNO:26的PPO参考序列相比,在编码A220的序列处发生靶向修饰。36.根据权利要求24所述的方法,其中与编码根据SEQIDNO:26的PPO参考序列相比,编码G221的序列处发生靶向修饰。37.根据权利要求24所述的方法,其中与根据SEQIDNO:26的PPO参考序列相比,在编码N425的序列处发生靶向修饰。38.根据权利要求24所述的方法,其中与根据SEQIDNO:26的PPO参照序列相比,在编码Y426的序列处或编码I475的序列处发生靶向修饰。39.权利要求25的方法,其中与根据SEQIDNO:27的EPSPS参考序列相比,在编码G101和G144的序列处发生靶向修饰。40.根据权利要求25所述的方法,其中与根据SEQIDNO:27的EPSPS参考序列相比,在编码G101和A192的序列处发生靶向修饰。41.根据权利要求25所述的方法,其中与根据SEQIDNO:27的EPSPS参考序列相比,在编码T102和P106的序列处发生靶向修饰。42.权利要求1的方法,其中所述至少一种表型可选择性状是可用于鉴定或分离至少一种经修饰的植物细胞、组织、器官或完整植物的可见表型。43.如权利要求42所述的方法,其中所述至少一种表型可选择性状是光泽表型。44.根据权利要求42所述的方法,其中所述至少一种表型可选择性状是金表型。45.根据权利要求42所述的方法,其中所述至少一种表型可选择性状是色素沉着表型或生长优势表型。46.根据权利要求1所述的方法,其中所述至少一个待修饰的植物细胞优选源自选自以下的植物:大麦(Hordeumvulgare)、球茎大麦(Hordeumbulbusom)、双色高粱(Sorghumbicolor)、甘蔗(Saccharumofficinarium)、玉蜀黍属(Zeaspp.)包括玉米(Zeamays)、小米(Setariaitalic)、小粒稻(Oryzaminuta)、水稻(Oryzasativa)、澳洲野生稻(Oryzaaustraliensis)、高秆野生稻(Oryzaalta)、普通小麦(Triticumaestivum)、硬粒小麦(Triticumdurum)、黑麦(Secalecereale)、黑小麦(Triticale)、苹果(Malusdomestica)、紫短柄草(Brachypodiumdistachyon)、海滨大麦(Hordeummarinum)、节节麦(Aegilopstauschii)、Daucusglochidiatus、甜菜属(Betaspp.)包括甜菜(Betavulgaris)、小胡萝卜(Daucuspusillus)、Daucusmuricatus、胡萝卜(Daucuscarota)、巨桉(Eucalyptusgrandis)、美花烟草(Nicotianasylvestris)、绒毛状烟草(Nicotianatomentosiformis)、烟草(Nicotianatabacum)、本氏烟草(Nicotianabenthamiana)、番茄(Solanumlycopersicum)、马铃薯(Solanumtuberosum)、中果咖啡(Coffeacanephora)、葡萄(Vitisvinifera)、Erythranteguttata、螺旋狸藻(Genliseaaurea)、黄瓜(Cucumissativus)、川桑(Morusnotabilis)、Arabidopsisarenosa、深山南芥(Arabidopsislyrata)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)、喜马拉雅鼠耳芥(Crucihimalayahimalaica)、卵叶须弥芥(Crucihimalayawallichii)、弯曲碎米荠(Cardamineflexuosa)、北美独行菜(Lepidiumvirginicum)、荠菜(Capsellabursapastoris)、Olmarabidopsispumila、筷子芥(Arabishirsute)、欧洲油菜(Brassicanapus)、甘蓝(Brassicaoeleracia)、芜菁(Brassicarapa)、萝卜(Raphanussativus)、芥菜(Brassicajuncea)、黑芥(Brassicanigra)、Erucavesicariasubsp.sativa、甜橙(Citrussinensis)、麻风树(Jatrophacurcas)、毛果杨(Populustrichocarpa)、蒺藜状苜蓿(Medicagotruncatula)、山下鹰嘴豆(Ciceryamashitae)、Cicerbijugum、鹰嘴豆(Cicerarietinum)、网状鹰嘴豆(Cicerreticulatum)、Cicerjudaicum、木豆(Cajanuscajanifolius)、蔓草虫豆(Cajanusscarabaeoides)、菜豆(Phaseolusvulgaris)、大豆(Glycinemax)、棉属(Gossypiumsp.)、紫云英(Astragalussinicus)、百脉根(Lotusjaponicas)、夏堇(Toreniafournieri)、洋葱(Alliumcepa)、葱(Alliumfistulosum)、蒜(Alliumsativum)、向日葵(Helianthusannuus)、菊芋(Helianthustuberosus)和韭菜(Alliumtuberosum),或属于上述植物之一的任何变种或亚种。47.用于分离至少一个经修饰的植物细胞或包含所述至少一个经修饰的植物细胞的至少一个经修饰的植物组织、器官或完整植物而不稳定整合转基因可选择标记序列的方法,所述方法包括:(a)使用至少一个第一位点特异性效应物将至少一个第一靶向密码子缺失修饰引入至少一个待修饰植物细胞的第一植物基因组靶位点,所述至少一个第一位点特异性效应物包含核酸酶、重组酶或DNA修饰试剂,其中所述至少一个靶向密码子缺失修饰引起至少一种表型可选择性状的表达;(b)将至少一个第二靶向修饰引入至少一个待修饰植物细胞的第二植物基因组靶位点,其中使用至少一个第二位点特异性效应物引入所述至少一个第二靶向修饰以在所述第二植物基因组靶位点处产生至少一个第二靶向修饰,其中所述至少一个第二靶向修饰与所述至少一个第一靶向碱基修饰的引入同时地或在所述至少一个第一靶向碱基修饰的引入之后被引入至相同的至少一个待修饰植物细胞,或者被引入至其包含所述至少一个第一靶向修饰的至少一个后代细胞、组织、器官或植物,从而获得至少一个经修饰的植物细胞;和(c)分离至少一个经修饰的植物细胞、组织、器官或完整植物,或者分离其至少一个后代细胞、组织、器官或植物,通过选择(i)在所述第一植物基因组靶位点处的至少一个第一靶向密码子缺失修饰造成的至少一种表型可选择性状,以及任选地通过进一步选择(ii)所述第二植物基因组靶位点中的至少一个第二靶向修饰,(d)任选地:将包含所述至少一个第一和所述至少一个第二靶向修饰的至少一个经修饰的植物或植物材料与另外的感兴趣的植物或植物材料杂交以使所获得的后代植物或植物材料分离以产生感兴趣的基因型,任选地其中所述感兴趣的基因型不包含所述至少一个第一靶向修饰。48.如权利要求47所述的方法,其中优选步骤(b)另外包括引入修复模板以在所述至少一个第一和/或第二植物基因组靶位点进行靶向序列转换或置换。49.根据权利要求47所述的方法,其中所述至少一个位点特异性效应物选自以下的至少一种:CRISPR核酸酶(包括Cas或Cpf1核酸酶),TALEN,ZFN,大范围核酸酶,Argonaute核酸酶,限制性内切酶(包括FokI或其变体),重组酶或两个位点特异性切口内切核酸酶,或前述效应物的任何变体或催化活性片段。50.根据权利要求47所述的方法,其中所述至少一种位点特异性效应物是基于CRISPR的核酸酶,其中所述基于CRISPR的核酸酶包含位点特异性DNA结合结构域,其中所述至少一种基于CRISPR的核酸酶或编码其的核酸序列,选自包括以下的组:(a)Cas9,包括SpCas9、SaCas9、SaKKH-Cas9、VQR-Cas9、St1Cas9,(b)Cpf1,包括AsCpf1、LbCpf1、FnCpf1,(c)CasX或(d)CasY,或前述基于CRISPR的核酸酶的任何变体或衍生物,任选地其中所述至少一种基于CRISPR的核酸酶与相应的野生型序列相比包含突变,从而产生的基于CRISPR的核酸酶被转变为单链特异性DNA切口酶或缺乏全部DNA切割能力的DNA结合效应物。51.根据权利要求47所述的方法,其中所述至少位点特异性效应物或包含所述至少一个位点特异性效应物的复合物的至少一个组分包含至少一个细胞器定位信号以将所述至少一个碱基编辑复合物靶向至亚细胞细胞器。52.根据权利要求51所述的方法,其中所述至少一个细胞器定位信号是核定位信号(NLS)。53.根据权利要求51所述的方法,其中所述至少一个细胞器定位信号是叶绿体转运肽。54.根据权利要求51所述的方法,其中所述至少一个细胞器定位信号是线粒体转运肽。55.根据权利要求47所述的方法,其中所述至少一种植物细胞的第一植物基因组靶位点是编码至少一种表型可选择性状的基因组靶位点,其中所述至少一种表型可选择性状是抗性/耐受性状或生长优势性状,并且其中在所述至少一种植物细胞的所述第一植物基因组靶位点处的所述至少一个第一靶向碱基修饰赋予针对待添加至所述至少一个经修饰的植物细胞、组织或植物、或其后代的化合物或触发剂的抗性/耐受性或生长优势。56.权利要求47的方法,其中所述至少一种感兴趣的表型可选择性状是至少一个内源基因或由至少一个内源基因编码,或所述至少一种感兴趣的表型性状是至少一个转基因或由其编码,其中所述至少一个内源基因或至少一个转基因编码选自以下的至少一种表型性状:对抑制、破坏或杀死在所述至少一种表型性状上缺乏所述至少一个修饰的细胞的植物毒素优选除草剂的抗性/耐受性,或者其中所述至少一种表型性状选自增强的细胞分裂,生长速率,胚胎发生或另一种为经修饰的细胞、组织、器官或植物提供相对于未经修饰的细胞、组织、器官或植物的优势的表型可选择的特性。57.根据权利要求47所述的方法,其中所述至少一个第一植物基因组靶位点是编码选自除草剂抗性/耐受性的至少一种表型可选择性状的至少一个内源基因或转基因,其中除草剂抗性/耐受性选自包括对EPSPS抑制剂(包括草甘膦)的抗性/耐受性;对谷氨酰胺合成抑制剂(包括草铵膦)的抗性/耐受性;对ALS-或AHAS-抑制剂(包括咪唑啉或磺酰脲)的抗性/耐受性;对ACCase抑制剂(包括芳氧基苯氧基丙酸(FOP))的抗性/耐受性;对类胡萝卜素生物合成抑制剂的抗性/耐受性,包括八氢番茄红素去饱和酶步骤的类胡萝卜素生物合成抑制剂、4-羟基苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)抑制剂或其他类胡萝卜素生物合成靶抑制剂;对纤维素抑制剂的抗性/耐受性;对脂质合成抑制剂的抗性/耐受性;对长链脂肪酸抑制剂的抗性/耐受性;对微管组装抑制剂的抗性/耐受性;对光系统I电子分流剂的抗性/耐受性;对光系统II抑制剂(包括氨基甲酸酯、三嗪类和三嗪酮类)的抗性/耐受性;对PPO-抑制剂的抗性/耐受性和对合成生长素(包括麦草畏(2,4-D,即2,4-二氯苯氧乙酸))的抗性/耐受性。58.根据权利要求47所述的方法,其中所述至少一种表型可选择性状是植物毒性抗性/耐受性状,优选除草剂抗性/耐受性状,并且其中所述至少一个待修饰植物细胞的第一植物基因组靶位点处的至少一个第一靶向密码子缺失或移码或缺失修饰赋予对植物毒性化合物优选除草剂的抗性/耐受性,所述化合物是待施加至所述至少一个经修饰的植物细胞、组织、器官或完整植物或其后代的外源化合物。59.根据权利要求58所述的方法,其中出于选择的目的,所述至少一个植物细胞的第一植物基因组靶位点是来自长芒苋(Amaranthustu...

【专利技术属性】
技术研发人员:高彩霞张瑞刘金星A·赫梅尔Z·瓦格齐帕瓦拉M·拉布斯
申请(专利权)人:中国科学院遗传与发育生物学研究所
类型:发明
国别省市:北京,11

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