本发明专利技术公开了一种定量检测产2‑甲基异莰醇菌株的方法及装置，该方法包括：取地表水水样，经过微孔过滤后，将滤膜进行总DNA提取纯化，得到DNA样本；以获得的DNA样本为模板进行PCR扩增；对PCR扩增产物进行纯化；将纯化后的DNA进行质粒转化过程，获得转化了质粒的白色菌落；选取饱满的单菌落接种于培养液中振荡培养过夜，以用于菌液PCR鉴定和测序分析；将经过鉴定分析的白色菌落提取质粒，测定质粒浓度后梯度稀释，将稀释后的质粒作为标准样品，建立标准样品浓度与临界循环数对应的标准曲线；取之前得到的DNA样本作为模板，进行定量PCR测定获得待测样本，根据所述标准曲线确定待测样本中产2‑甲基异莰醇菌株的浓度。
【技术实现步骤摘要】
一种定量检测产2-甲基异莰醇菌株的方法及装置
本专利技术涉及分子生物学领域，特别是涉及一种定量检测产2-甲基异莰醇菌株的方法及装置。
技术介绍
2-甲基异莰醇是水中常见的嗅味物质，主要由放线菌、真菌和蓝绿藻代谢产生，其在水中的嗅味阈值极低(10ng/L)。湖泊和水库的水体富营养化会产生嗅味物质，当水体发生富营养化后，在水体中可以检测到2-甲基异莰醇。广大消费者认为嗅味问题是影响饮用水水质的关键因素，产生异味不但影响人们的感官特征，甚至能对人的健康产生危害。嗅味问题已经在全球范围内产生了严重的影响，早在上世纪80年代的瑞士、芬兰、美国、加拿大、澳大利亚、英国、日本等国家均产生了严重的嗅味问题。我国随经济的发展对供水水质的要求也日益提高，此类问题近年来也已引起广泛的关注众所周知，蓝藻水华时可产生2-甲基异莰醇，此过程在几天内就可迅速完成，因此，这就需要水质监测部门能够快速检测2-甲基异莰醇。常规条件下可通过人的感官、气相色谱和质谱联用法测定嗅味物质的含量。但这些方法都要耗费大量的时间、精力，错过了嗅味物质风险预警分析的最佳时机。因此，建立高灵敏度、高特异性的定量检测方法迫在眉睫。
技术实现思路
为克服上述现有技术存在的不足，本专利技术之目的在于提供一种定量检测产2-甲基异莰醇菌株的方法及装置，以快速准确的测定地表水中产2-甲基异莰醇菌株的浓度。为达上述及其它目的，本专利技术提出一种定量检测产2-甲基异莰醇菌株的方法，包括如下步骤：步骤一，取地表水水样，经过微孔过滤后，将滤膜进行总DNA提取纯化，得到DNA样本；步骤二，以步骤一获得的DNA样本为模板进行PCR扩增；步骤三，对PCR扩增产物进行纯化；步骤四，将纯化后的DNA进行质粒转化过程，获得转化了质粒的白色菌落；步骤五，选取饱满的单菌落接种于培养液中，并振荡培养过夜，以用于菌液PCR鉴定和测序分析；步骤六，将经过鉴定分析的白色菌落提取质粒，测定质粒浓度后，梯度稀释，将稀释后的质粒作为标准样品，建立标准样品的浓度与临界循环数对应的一元线性回归曲线，即得到标准曲线；步骤七，取步骤一中得到的DNA样本作为模板，进行定量PCR测定获得待测样本，根据所述标准曲线确定待测样本中产2-甲基异莰醇菌株的浓度。优选地，于步骤二中，采用PCR反应体系为50μL，引物信息如下：上游引物5’-CGATTGGTCGGTATTAGAGGCT-3’(SEQIDNO.1)、下游引物5’-ATCACGCGGTCATCAGGCTT-3’(SEQIDNO.2)，反应程序为：95℃预变性5分钟，随后94℃15秒，退火温度60℃45秒和72℃延伸40秒，进行45个循环，最终72℃延伸10分钟，并通过1.5％(wt/vol)的琼脂糖凝胶电泳确认产物。优选地，于步骤三中，利用DNA胶回收试剂盒进行胶回收，对PCR扩增产物进行纯化，并通过1.5％的琼脂糖凝胶电泳确认回收是否成功。优选地，于步骤四中，将经步骤三纯化后的DNA插入质粒载体中，并进一步转化到DH5α感受态大肠杆菌溶液，然后涂布到加入Amp抗性的LB固体培养基上，通过蓝白斑筛选，挑选转化了质粒的白色菌落。优选地，于步骤五中，选取饱满的单菌落接种于含有Amp的液体LB培养液中，于37℃、180-200转/分钟振荡培养过夜，以用于菌液PCR鉴定和测序分析。优选地，步骤七进一步包括：加入实时定量PCR所需试剂，反应体系为20μL，2μLDNA样品；进行实时定量PCR反应，进行PCR扩增；反应结束后，将DNA样本的循环阈值Ct与标准曲线对照，计算DNA样本的pgmts基因的拷贝数，从而得到原水中pgmts基因的拷贝数，并分析得到水样中pgmts基因的浓度。优选地，于步骤七中，采用两步法进行PCR扩增，反应条件为：预变性，1个循环，95℃15；PCR反应，45个循环，95℃5秒，60℃45秒。为达到上述目的，本专利技术还提供一种定量检测产2-甲基异莰醇菌株的装置，包括：DNA样本提取单元，用于通过取地表水水样，经过微孔过滤后，将滤膜进行总DNA提取纯化，得到DNA样本；PCR扩增单元，以所述DNA样本提取单元获得的DNA样本为模板进行PCR扩增；纯化单元，用于对PCR扩增产物进行纯化；质粒转化单元，用于将纯化后的DNA进行质粒转化过程，获得转化了质粒的白色菌落；鉴定分析单元，用于选取饱满的单菌落接种于培养液中，并振荡培养过夜，以用于菌液PCR鉴定和测序分析；标准曲线建立单元，用于将经过鉴定分析的白色菌落提取质粒，测定质粒浓度后，梯度稀释，将稀释后的质粒作为标准样品，建立标准样品的浓度与临界循环数对应的一元线性回归曲线，即得到标准曲线；定量PCR检测单元，用于取所述DNA样本提取单元得到的DNA样本作为模板，进行定量PCR测定获得待测样本，根据所述标准曲线确定待测样本中产2-甲基异莰醇菌株的浓度。优选地，所述PCR扩增单元采用PCR反应体系为50μL，引物信息如下：上游引物5’-CGATTGGTCGGTATTAGAGGCT-3’(SEQIDNO.1)、下游引物5’-ATCACGCGGTCATCAGGCTT-3’(SEQIDNO.2)，反应程序为：95℃预变性5分钟，随后94℃15秒，退火温度60℃45秒和72℃延伸40秒，进行45个循环，最终72℃延伸10分钟，并通过1.5％(wt/vol)的琼脂糖凝胶电泳确认产物。优选地，所述定量PCR检测单元通过如下步骤实现：加入实时定量PCR所需试剂，反应体系为20μL，2μLDNA样品；进行实时定量PCR反应，进行PCR扩增；反应结束后，将DNA样本的循环阈值Ct与标准曲线对照，计算DNA样本的pgmts基因的拷贝数，从而得到原水中pgmts基因的拷贝数，并分析得到水样中pgmts基因的浓度。与现有技术相比，本专利技术一种定量检测产2-甲基异莰醇菌株的方法及装置通过设计基因pgmts的引物，并通过提取待检测样本的DNA，进行定量PCR检测，最后根据标准曲线计算出待测样本的pgmts基因的拷贝数和产2-甲基异莰醇菌株的浓度。本专利技术方法操作简便、易于掌握，可以快速准确的测定地表水中产2-甲基异莰醇菌株的浓度。附图说明图1为本专利技术一种定量检测产2-甲基异莰醇菌株的方法的步骤流程图；图2为本专利技术一种定量检测产2-甲基异莰醇菌株的装置的系统架构图。具体实施方式以下通过特定的具体实例并结合附图说明本专利技术的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭示的内容轻易地了解本专利技术的其它优点与功效。本专利技术亦可通过其它不同的具体实例加以施行或应用，本说明书中的各项细节亦可基于不同观点与应用，在不背离本专利技术的精神下进行各种修饰与变更。图1为本专利技术一种定量检测产2-甲基异莰醇菌株的方法的步骤流程图。如图1所示，本专利技术一种定量检测产2-甲基异莰醇菌株的方法，包括如下步骤：步骤101，取地表水水样，经微孔过滤后，将滤膜进行总DNA提取纯化，得到DNA样本。具体地，取地表水水样，经过0.22μm微孔过滤后，将滤膜进行总DNA提取纯化，得到DNA样本。步骤102，以步骤101中的DNA样本为模板进行PCR扩增，反应体系为50μL。引物信息如下：上游引物5’-CGATTGGTCGGTATTAGAGGCT-3’(SEQIDNO.1)、下游引物5’-ATCACGCGG本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种定量检测产2‑甲基异莰醇菌株的方法，包括如下步骤：步骤一，取地表水水样，经过微孔过滤后，将滤膜进行总DNA提取纯化，得到DNA样本；步骤二，以步骤一获得的DNA样本为模板进行PCR扩增；步骤三，对PCR扩增产物进行纯化；步骤四，将纯化后的DNA进行质粒转化过程，获得转化了质粒的白色菌落；步骤五，选取饱满的单菌落接种于培养液中，并振荡培养过夜，以用于菌液PCR鉴定和测序分析；步骤六，将经过鉴定分析的白色菌落提取质粒，测定质粒浓度后，梯度稀释，将稀释后的质粒作为标准样品，建立标准样品的浓度与临界循环数对应的一元线性回归曲线，即得到标准曲线；步骤七，取步骤一中得到的DNA样本作为模板，进行定量PCR测定获得待测样本，根据所述标准曲线确定待测样本中产2‑甲基异莰醇菌株的浓度。
【技术特征摘要】
1.一种定量检测产2-甲基异莰醇菌株的方法，包括如下步骤：步骤一，取地表水水样，经过微孔过滤后，将滤膜进行总DNA提取纯化，得到DNA样本；步骤二，以步骤一获得的DNA样本为模板进行PCR扩增；步骤三，对PCR扩增产物进行纯化；步骤四，将纯化后的DNA进行质粒转化过程，获得转化了质粒的白色菌落；步骤五，选取饱满的单菌落接种于培养液中，并振荡培养过夜，以用于菌液PCR鉴定和测序分析；步骤六，将经过鉴定分析的白色菌落提取质粒，测定质粒浓度后，梯度稀释，将稀释后的质粒作为标准样品，建立标准样品的浓度与临界循环数对应的一元线性回归曲线，即得到标准曲线；步骤七，取步骤一中得到的DNA样本作为模板，进行定量PCR测定获得待测样本，根据所述标准曲线确定待测样本中产2-甲基异莰醇菌株的浓度。2.如权利要求1所述的一种定量检测产2-甲基异莰醇菌株的方法，其特征在于：于步骤二中，采用PCR反应体系为50μL，引物信息如下：上游引物序列为SEQIDNO.1、下游引物序列为SEQIDNO.2，反应程序为：95℃预变性5分钟，随后94℃15秒，退火温度60℃45秒和72℃延伸40秒，进行45个循环，最终72℃延伸10分钟，并通过1.5％(wt/vol)的琼脂糖凝胶电泳确认产物。3.如权利要求1所述的一种定量检测产2-甲基异莰醇菌株的方法，其特征在于：于步骤三中，利用DNA胶回收试剂盒进行胶回收，对PCR扩增产物进行纯化，并通过1.5％的琼脂糖凝胶电泳确认回收是否成功。4.如权利要求1所述的一种定量检测产2-甲基异莰醇菌株的方法，其特征在于：于步骤四中，将经步骤三纯化后的DNA插入质粒载体中，并进一步转化到DH5α感受态大肠杆菌溶液，然后涂布到加入Amp抗性的LB固体培养基上，通过蓝白斑筛选，挑选转化了质粒的白色菌落。5.如权利要求1所述的一种定量检测产2-甲基异莰醇菌株的方法，其特征在于：于步骤五中，选取饱满的单菌落接种于含有Amp的液体LB培养液中，于37℃、180-200转/分钟振荡培养过夜，以用于菌液PCR鉴定和测序分析。6.如权利要求1所述的一种定量检测产2-甲基异莰醇菌株的方法，其特征在于，步骤七进一步包括：加入实时定量PCR所需试剂，反应体系为20μL，2μLDNA样品；进行实时定量PCR反应，进行PCR扩增；反应结束...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈蕾，姜蕾，
申请(专利权)人：上海城市水资源开发利用国家工程中心有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31
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