miR159在改变植物根系形态中的应用制造技术

本发明专利技术公开了miR159在改变植物根系形态中的应用，并公开了基于miR159的改变植物根系形态的方法。本发明专利技术利用大豆转基因技术过量表达miR159基因家族的miR159e，研究发现miR159e能够改变大豆根系形态，与野生型大豆相比，过表达miR159e的转基因大豆植株，主根长都有明显下降，根鲜重都有明显上升，高磷条件下作用更加明显，即过表达miR159e的转基因大豆植株的根系更加发达，具有更强的吸收养分能力和抵御干旱的能力，尤其是高磷条件下更加明显，在培育具有更强的吸收养分能力和抵御干旱能力的转基因大豆方面，具有更广泛的潜在应用前景。

【技术实现步骤摘要】
miR159在改变植物根系形态中的应用
本专利技术涉及植物基因工程
，更具体地，涉及miR159在改变植物根系形态中的应用。
技术介绍
MicroRNA(miRNA)是一类长度为20-24个核苷酸的非编码小分子RNA，在植物体内大量存在，能在转录后水平抑制基因的表达(Jones-Rhoadesetal.,2006；Rogersetal.,2013)。已有研究表明：miRNA在植物生长发育及非生物胁迫应答上，具有非常重要的作用。miR159在植物生长发育方面，起着至关重要的作用。有研究表明，miR159在不同植物种子萌发时被检测到，说明在不同物种间具有高度保守性(Axtelletal.,2005)；在拟南芥中，miR159家族中有三个成员miR159A、miR159B、miR159C(Chenetal.,2002)，其中miR159ab双突变会造成多效形态学缺陷，包括生长习性的改变，叶片的卷曲，变小的荚果和变小的种子，说明了miR159在植物生长发育中起到重要的作用，但是miR159a或者miR159b单独突变，不会出现miR159ab突变的缺陷，说明miR159家族成员之间存在冗余(Allenetal.,2007)，这种功能能够使植物更好应对外界多变的环境。目前研究显示，miR159对植物应对非生物胁迫具有十分重要的意义，如干旱胁迫、营养胁迫等。在干旱胁迫下，植物为适应环境会增加脱落酸(ABA)的表达(Banoetal.,1994；Figueiredoetal.,2008)。在miRNA生物合成中，关键基因hyl1-1突变，会对生长素、ABA、细胞分裂素应答减弱(Luetal.,2000)，说明miRNA参与其信号应答。在拟南芥种子萌发早期，miR159在ABA和干旱处理下被诱导表达。ABI3(abscisicacid-insensitive)和ABI5转录因子，在种子萌发ABA应答上，是一个非常重要的调控因子(Lopez-Molinaetal.,2002；Zhangetal.,2005)，在abi3和abi5突变体材料中，发现ABA诱导miR159的积累需要ABI3这个转录因子，但只是部分依赖ABI5；同时发现miR159的靶基因MYB33和MYB101，对种子萌发时ABA应答上，起一个正调控作用(Reyesetal.,2007)。磷作为植物不可缺少的矿质养分，不仅是构成核酸、磷脂、ATP等的组成成分，而且参与了光合作用、呼吸作用、能量传递及酶活性调节等生理生化过程；同时也是维持现代农业所必需的肥料主要成分之一(López-Arredondoetal.,2014)。大豆(Glycinemax)是世界上重要的粮油作物，miRNA在植物生长发育上，具有如此重要作用，对大豆生长发育也不例外，但是目前对大豆高低磷响应miRNA如何调控磷养分平衡尚不清楚。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术的不足，提供大豆miR159调解大豆根的形态的应用。本专利技术的第一个目的是提供miR159在改变植物根系形态中的应用。本专利技术的第二个目的是提供miR159前体全长序列在改变植物根系形态中的应用。本专利技术的第三个目的是提供一种重组载体在改变植物根系形态中的应用。本专利技术的第四个目的是提供一种工程菌在改变植物根系形态中的应用。本专利技术的第五个目的是提供miR159e在构建转基因大豆方面的应用以及构建转基因大豆的方法。本专利技术的第六个目的是提供一种改变植物根系形态的方法。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案予以实现的：专利技术人研究发现过表达大豆miR159e的转基因大豆，主根变短，根系鲜重增加，根系明显更加发达，具有更强的吸收养分的能力和抵御干旱的能力，尤其是在高磷处理时候，这种能力更加明显，因此本专利技术要求保护以下应用：miR159在改变植物系形态中的应用。miR159前体全长序列在改变植物根系形态中的应用。一种重组载体在改变植物根系形态中的应用，所述重组载体上有miR159前体全长序列。一种工程菌在改变植物根系形态中的应用，所述工程菌含有所述重组载体。优选地，所述植物为大豆、玉米、水稻、花生和苜蓿。更优选地，所述植物为大豆。优选地，miR159为大豆miR159e。本专利技术还要求保护miR159e在构建转基因大豆方面的应用，所述转基因大豆在高低磷条件下的根系更加发达，具有更强的吸收养分能力和抵御干旱的能力。一种改变植物根系形态的方法，将miR159在植物内过表达。一种构建转基因大豆的方法，是将miR159在植物内过表达；所述转基因大豆在高低磷条件下的根系更加发达，具有更强的吸收养分能力和抵御干旱的能力。以上所述的方法，步骤如下：S1.克隆miR159前体全长序列连接入表达载体，得到重组载体；S2.将重组载体转化入受体农杆菌，得到工程菌；S3.将大豆种子消毒后进行萌发；S4.接种工程菌，并扩大培养，制备得到侵染悬浮液；S5.处理侵染用外植体；S6.用侵染悬浮液充分浸泡处理过的侵染用外植体；S7.进行暗培养；S8.进行幼芽的诱导；S9.进行幼芽的伸长；S10.生根培养；S11.转基因植株的鉴定。优选地，步骤S1中，扩增引物的核苷酸序列为：上游引物：TAGCAAGGGTTTAGGTGGTG；下游引物：AGAGCAAGAACGAGATTATGG。优选地，步骤S1中，表达载体为pTF101.1。优选地，步骤S2中，农杆菌菌株为EHA101。优选地，步骤S3中，消毒步骤为：在可以密封的容器中放入大豆种子，加入次氯酸钠，然后沿着壁缓缓加入浓盐酸，静置密封过夜，次氯酸钠与浓盐酸的体积比为100：4.2。优选地，步骤S3中，将消毒大豆种子，转到萌发培养基(GM)上培养，萌发条件为16小时光照24℃/8小时黑暗24℃，培养4-5天。优选地，步骤S4中，将工程菌在50ml液体YEP培养基(抗生素)中扩大培养，28℃下200rpm培养20小时；之后5000rpm下将菌液离心10分钟，弃上清，用液体共培养液(CM)重悬菌液至OD650值为1.0-1.2。优选地，步骤S5中，处理侵染用外植体的方法为用已灭菌的解剖刀从离子叶节大约0.5cm的下胚轴切下萌发的种子，沿着子叶剖开种子，并剔除子叶节上幼芽。在子叶、下胚轴和子叶节区域垂直于轴切出7-8个切口。优选地，步骤S6中，用侵染悬浮液充分浸泡处理过的侵染用外植体的方法为充分浸泡外植体30分钟。优选地，步骤S7中，进行暗培养的方法为：将浸泡过的外植体转移到固体CM培养基上，切口向下，用保鲜膜封住培养皿，水平放置在人工气候室暗培养3天。优选地，步骤S8中，进行幼芽的诱导的方法为：在液体幼芽诱导培养液(SI)中清洗后，将外植体45°角斜插在固体SI培养基上，培养皿用医用透气胶带封口，人工气候室(16小时光照24℃/8小时黑暗24℃)培养；2周后，在子叶节切去下胚轴，将新的切面插入至新的SI培养基中继代培养2周。优选地，步骤S9中，进行幼芽的伸长的方法为：切除未分化的外植体及子叶，并在分化的外植体基部切一个新切口，然后转移到幼芽伸长培养基(SE)上，培养皿用医用透气胶带封口，人工气候室(16小时光照24℃/8小时黑暗24℃)培养2－8周。每2周更换一次SE培养基，每次剔除老化的愈伤组织，在外植体基部切本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.miR159在改变植物根系形态中的应用。

【技术特征摘要】
1.miR159在改变植物根系形态中的应用。2.miR159前体全长序列在改变植物根系形态中的应用。3.一种重组载体在改变植物根系形态中的应用，其特征在于，所述重组载体上有miR159前体全长序列。4.一种工程菌在在改变植物根系形态中的应用，其特征在于，所述工程菌含有权利要求3中所述的重组载体。5.根据权利要求1到4任一所述应用，其特征在于，所述植物为大豆、玉米、水稻、花生和苜蓿。6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，miR159为大豆miR159e。7.miR159e在构建转基因大豆方面的应用，其特征在于，所述转基因大豆在高低磷条件下的根系更加发达，具有更强的吸收养分能力和抵御干旱的能力。8.一种改变植物根系形态的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：王金祥，何平安，李波娣，徐锋，陶平，许志豪，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44