一种PSR等温扩增反应检测大肠杆菌志贺毒素的引物、试剂盒及其方法技术

技术编号:19448200 阅读:19 留言:0更新日期:2018-11-14 17:12
本发明专利技术公开了一种PSR等温扩增反应检测大肠杆菌志贺毒素的引物、试剂盒及其方法。该引物包括检测引物Ft和检测引物Bt;其中,检测引物Ft的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;检测引物Bt的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术还提供了一种PSR等温扩增反应检测大肠杆菌志贺毒素试剂盒,该试剂盒包括上述引物,Bst DNA聚合酶,以及钙黄绿素和氯化锰的混合溶液等,能对大肠杆菌志贺毒素进行聚合酶螺旋反应的检测,不会因温度的改变而造成时间损失,耗时短,反应过程简便、检测周期短、特异性强、可用肉眼观察检测结果。本发明专利技术对新型恒温扩增技术扩增的开发及微生物的现场检测具有重要的意义。

【技术实现步骤摘要】
一种PSR等温扩增反应检测大肠杆菌志贺毒素的引物、试剂盒及其方法
本专利技术属于生物
,特别涉及一种PSR等温扩增反应检测大肠杆菌志贺毒素的引物、试剂盒及其方法。
技术介绍
志贺毒素主要是由大肠杆菌产生的,产志贺毒素大肠杆菌(shigatoxin-producingEscheriachiacoli,STEC)—是食品主要致病菌之一。STEC主要毒力因子位于噬菌体上的stx1、stx2基因上,这两种基因分别编码志贺毒素Stx1、Stx2。志贺毒素Stx1、Stx2导致病人感染的剂量很低,可导致病人剧烈腹痛和腹泻,严重者发生急性肾衰竭而死亡。目前对志贺毒素的检测方法主要有传统的生化鉴定方法,以及分子生物技术的PCR方法,还有以免疫学为主的酶联免疫试剂盒和应用各类生化自动鉴定仪的检测方法,以及最新出现的基因芯片检测手段。常规检测鉴定方法工作量相对较大且检测结果一般4~5天才能得出结果,耗时长,根据实验现象判断鉴定结果,很难满足快速鉴定的需要。近年来发展起来的基因芯片检测及PCR扩增方法具有较强的特异性、快速、灵敏,但是成本较高。免疫学检测方法,如ELISA,免疫层析等,灵敏度高,但是操作过程复杂,成本偏高,不宜于大规模检测样品。目前应用最广泛的恒温扩增技术-LAMP也有它的局限性,如引物设计复杂、假阳性率高、试剂价高偏高,且由于日本知识产权的保护,我国在转化应用上局限性强。聚合酶螺旋反应(PolymeraseSpiralReaction,PSR)技术与其他核酸扩增技术相比,可以在等温条件下快速、高效、特异地扩增靶序列,且操作简便,不需要精准的变温设备,成本较低,在食源性微生物检测领域显示出广阔的发展前景。因此,建立一种针对大肠杆菌志贺毒素新型的具有独立知识产权的等温核酸扩增方法具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足,提供一种PSR等温扩增反应检测大肠杆菌志贺毒素的引物。本专利技术的另一目的在于提供一种PSR等温扩增反应检测大肠杆菌志贺毒素的试剂盒。本专利技术的另一目的在于提供一种PSR等温扩增反应检测大肠杆菌志贺毒素的方法。其具有灵敏度高、特异性好,操作简便快速,结果准确可靠,检测成本低,适合现场检测应用的特点。本专利技术的目的通过下述技术方案实现:一种PSR等温扩增反应检测大肠杆菌志贺毒素的引物,包括检测引物Ft和检测引物Bt,其核苷酸序列如下所示:检测引物Ft:5’-CTCTTCAGCCAGTCGTCGTGCAACAGCGACATCATCCG-3’(SEQIDNO.1);检测引物Bt:5’-GTGCTGCTGACCGACTTCTCATTCCTTCCCGTAACAACT-3’(SEQIDNO.2)。一种PSR等温扩增反应检测大肠杆菌志贺毒素的试剂盒,包括上述PSR等温扩增反应检测大肠杆菌志贺毒素的引物。所述的PSR等温扩增反应检测大肠杆菌志贺毒素的引物中检测引物Ft和检测引物Bt的浓度均为50μM。所述的PSR等温扩增反应检测大肠杆菌志贺毒素的试剂盒,还包括如下组分:A、2×反应缓冲液:40.0mM的Tris-HCl,20.0mM的硫酸铵,20.0mM的氯化钾,16.0mM的硫酸镁,0.2%(v/v)的Tween20,1.4M的甜菜碱,10.0mM的dNTPs(each);B、BstDNA聚合酶;C、钙黄绿素和氯化锰的混合溶液。组分B中所述的BstDNA聚合酶优选为浓度为8U/μL的BstDNA聚合酶水溶液。组分C中所述的钙黄绿素和氯化锰的混合溶液通过如下方法制备得到:(i)将钙黄绿素溶于二甲基亚砜(DMSO)中,配置50μM的钙黄绿素溶液;将氯化锰溶于水中,配置1mM的氯化锰水溶液;(ii)取25μL50μM的钙黄绿素溶液与10μL1mM的氯化锰水溶液混合均匀,得到钙黄绿素和氯化锰的混合溶液(钙黄绿素溶液与氯化锰溶液的浓度比为1:8)。所述的PSR等温扩增反应检测大肠杆菌志贺毒素的试剂盒在检测大肠杆菌志贺毒素中的应用。一种PSR等温扩增反应检测大肠杆菌志贺毒素的方法,包括如下步骤:(1)提取待检样品的细菌DNA作为模板DNA,并控制模板DNA水溶液的OD260/OD280值为1.8~2.0;(2)于65℃水浴中保温40~45分钟进行聚合酶螺旋扩增反应;其中,聚合酶螺旋扩增反应体系为26μL反应体系:2×反应缓冲液12.5μL,50μM的检测引物Ft和50μM的检测引物Bt各0.8μL,DNA模板2.0μl,8U/μL的BstDNA聚合酶1.0μL,去离子水补足至25μL;最后加入1μL的钙黄绿素与氯化锰的混合溶液;(3)待反应完成后于80℃水浴中保温2分钟终止反应,然后用肉眼观察颜色变化,如颜色为黄色,说明待检样品中不含有大肠杆菌志贺毒素;如颜色变为绿色,说明待检样品中含有大肠杆菌志贺毒素。步骤(2)中所述的检测引物Ft的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示,检测引物Bt的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。步骤(2)中所述的钙黄绿素和氯化锰的混合溶液通过如下方法制备得到:(i)将钙黄绿素溶于二甲基亚砜(DMSO)中,配置50μM的钙黄绿素溶液;将氯化锰溶于水中,配置1mM的氯化锰水溶液;(ii)取25μL50μM的钙黄绿素溶液与10μL1mM的氯化锰水溶液混合均匀,得到钙黄绿素和氯化锰的混合溶液(钙黄绿素溶液与氯化锰溶液的浓度比为1:8)。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果:(1)本专利技术中所提供的针对志贺毒素异性靶序列stx2所设计的聚合酶螺旋检测鉴定体系,解决现有技术中的方法所需周期长,灵敏度低,成本高,现场应用困难等缺陷。(2)本专利技术的方法可以将检测时间减少到60分钟,同传统环介导等温扩增技术相比速断检测周期,对新型恒温扩增技术扩增的开发及微生物的现场检测具有重要的意义。同时,本专利技术还公开了针对志贺毒素的特异性靶序列stx2(GenebankAccessionNo.AF162758.1)保守区的特异区域设计了一对检测引物,从而保证了检测结果的可靠性。其次,本专利技术在等温条件下扩增,不会因温度的改变而造成时间损失,耗时短,在60分钟就可完成结果判读。此外,该技术不需要特殊、昂贵的仪器和试剂,扩增产物不需要凝胶电泳,直接用荧光染料显色可凭肉眼判断结果,操作简便快捷,检测成本较低。本专利技术的试剂盒及方法特别适用中小型单位及现场检测。附图说明图1为聚合酶螺旋反应技术检测志贺毒素的结果及凝胶电泳结果图;其中,图A为聚合酶螺旋反应技术检测志贺毒素的结果(NG为空白对照;1为大肠杆菌O157:H7ATCC43895,2为大肠杆菌E019,3为大肠杆菌E020,4为大肠杆菌E043,5为大肠杆菌E044);图B为聚合酶螺旋反应技术检测志贺毒素的凝胶电泳结果(泳道NG为空白对照;泳道1为大肠杆菌O157:H7ATCC43895,泳道2为大肠杆菌E019,泳道3为大肠杆菌E020,泳道4为大肠杆菌E043,泳道5为大肠杆菌E044)。图2为特异性检测实验结果图;其中,1:大肠杆菌E019;2:大肠杆菌E020;3:大肠杆菌E043;4:大肠杆菌E044;5:大肠杆菌ATCC43895;6:沙门氏菌ATCC29629;7:沙门氏菌ATCC19585;8:沙门氏菌ATCC14028;本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种PSR等温扩增反应检测大肠杆菌志贺毒素的引物,其特征在于:包括检测引物Ft和检测引物Bt;其中,检测引物Ft的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;检测引物Bt的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种PSR等温扩增反应检测大肠杆菌志贺毒素的引物,其特征在于:包括检测引物Ft和检测引物Bt;其中,检测引物Ft的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示;检测引物Bt的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。2.一种PSR等温扩增反应检测大肠杆菌志贺毒素的试剂盒,其特征在于:包括权利要求1所述的PSR等温扩增反应检测大肠杆菌志贺毒素的引物。3.根据权利要求2所述的PSR等温扩增反应检测大肠杆菌志贺毒素的试剂盒,其特征在于:所述的PSR等温扩增反应检测大肠杆菌志贺毒素的引物中检测引物Ft和检测引物Bt的浓度均为50μM。4.根据权利要求3所述的PSR等温扩增反应检测大肠杆菌志贺毒素的试剂盒,其特征在于,还包括如下组分:A、2×反应缓冲液:40.0mM的Tris-HCl,20.0mM的硫酸铵,20.0mM的氯化钾,16.0mM的硫酸镁,0.2%(v/v)的Tween20,1.4M的甜菜碱,10.0mM的dNTPs;B、BstDNA聚合酶;C、钙黄绿素和氯化锰的混合溶液。5.根据权利要求4所述的PSR等温扩增反应检测大肠杆菌志贺毒素的试剂盒,其特征在于,组分C中所述的钙黄绿素和氯化锰的混合溶液通过如下方法制备得到:(i)将钙黄绿素溶于二甲基亚砜中,配置50μM的钙黄绿素溶液;将氯化锰溶于水中,配置1mM的氯化锰水溶液;(i...

【专利技术属性】
技术研发人员:刘君彦徐振波徐行勇徐瑞瑞苏健裕刘丽艳李冰李琳
申请(专利权)人:华南理工大学
类型:发明
国别省市:广东,44

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