一种类球红细菌高产菌株的遗传转化方法技术

本发明专利技术公开了一种类球红细菌高产菌株的遗传转化方法。本发明专利技术首先通过实验证明接合转移法并不合适一株类球红细菌辅酶Q10的高产菌株，而电转化方法适用于此高产菌株。通过实验结果表明：本发明专利技术的电转化方法不仅适用于该高产菌株，对其他类球红细菌的野生型菌株也同样有效。并以此方法出发，构建了多株过表达重组菌株，证实了此法的有效性和可重复性。

【技术实现步骤摘要】
一种类球红细菌高产菌株的遗传转化方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种类球红细菌高产菌株的遗传转化方法。
技术介绍
类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)是一类球形的革兰氏阴性菌，可天然合成具抗氧化功能的醌类物质辅酶Q10。为了进一步提高辅酶Q10的产量，非常有必要通过分子改造的手段优化辅酶Q10的合成途径。目前，研究者主要应用双亲接合转移的方法对类球红细菌野生型菌株进行遗传操作，但是双亲接合转移法并不适用于所有类球红细菌菌株。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种类球红细菌的转化方法。本专利技术提供的类球红细菌的转化方法包括如下步骤：(1)将类球红细菌接种于培养基中进行培养，收集菌体；将所述菌体依次进行洗涤和重悬后，得到类球红细菌感受态细胞；所述类球红细菌感受态细胞的OD值为7.7-9.3；(2)将外源质粒与所述类球红细菌感受态细胞混合，得到细胞混合物，将所述细胞混合物进行电击转化，得到重组菌。在本专利技术的具体实施例中，所述类球红细菌感受态细胞的OD值为8.0。上述方法中，所述外源质粒与所述类球红细菌感受态细胞的配比为1ng：(0.75-1.50)μL。在本专利技术的具体实施例中，所述外源质粒与所述类球红细菌感受态细胞的配比为1ng：1.50μL；所述外源质粒为重组质粒pBBR1MCSK-idi或pBBR1MCSK-rs4253；所述重组质粒pBBR1MCSK-idi为将pBBR1MCS载体中的氯霉素抗性基因替换为卡那霉素抗性基因，且将序列1所示的DNA片段插入pBBR1MCS载体的KpnI和SacI多克隆位点间得到的质粒，其中，序列1所示的DNA片段依次由启动子、RBS、类球红细菌idi基因和终止子组成，类球红细菌idi基因为序列1第298-831位；所述重组质粒pBBR1MCSK-rs4253为将pBBR1MCS载体中的氯霉素抗性基因替换为卡那霉素抗性基因，且将序列2所示的DNA片段插入pBBR1MCS载体的KpnI和SacI多克隆位点间得到的质粒，其中，序列2所示的DNA片段依次由启动子、RBS、rs4253基因和终止子组成，rs4253基因为序列2第293-1492位。上述方法中，所述培养的方法为将类球红细菌株接种于培养基中培养至OD值为0.58-0.70。在本专利技术的具体实施例中，所述培养的方法包括如下步骤：1)从平板上挑取一个类球红细菌株JDW-610的菌落至5mL新鲜PYG培养基中，在32℃，220rpm摇箱中培养，直至对数生长期；2)以适当比例转接对数期的菌液至10mL新鲜PYG培养基中，接种后OD值约为0.1；3)在32℃，220rpm摇箱中过夜培养，直至OD值达到0.60。上述方法中，所述电击转化的电压为(0.8-1.8)kV，具体为0.8kV、0.9kV、1.0kV、1.1kV、1.2kV、1.25kV、1.3kV、1.4kV、1.5kV、1.6kV、1.7kV和1.8kV；所述电击转化的时间为5ms。上述方法中，所述洗涤和重悬的方法包括如下步骤：用水洗涤所述菌体，得到洗涤后菌体；再用甘油水溶液重悬所述洗涤后菌体，得到重悬后菌体，即为类球红细菌感受态细胞。上述方法中，所述水为去离子水；所述洗涤的次数为2次；所述甘油水溶液的体积分数为10％。上述方法中，所述电击转化后还包括复苏培养的步骤；所述复苏培养的条件为32℃，150rpm复苏2小时。上述方法中，所述类球红细菌为类球红细菌RhodobactersphaeroidesJDW-610或野生型类球红细菌Rhodobactersphaeroides(CGMCC编号为1.3368)。本专利技术的另一个目的是提供上述重组菌。本专利技术的最后一个目的是提供上述重组菌的新用途。本专利技术提供了上述重组菌在生产辅酶Q10中的应用。本专利技术首先通过实验证明接合转移法并不合适一株类球红细菌辅酶Q10的高产菌株，而电转化方法适用于此高产菌株。通过实验结果表明：本专利技术的电转化方法不仅适用于该高产菌株，对其他类球红细菌的野生型菌株也同样有效。并以此方法出发，构建了多株过表达重组菌株，证实了此法的有效性和可重复性。附图说明图1为pBBR1MCSK-idi质粒图谱。图2为转化子菌落PCR验证。1-21泳道的PCR模板为随机挑取的平板上生长的不同转化子；C指示的PCR模板为类球红细菌高产菌株质粒pBBR1MCSK-idi(阳性对照)；水为阴性对照。图3为类球红细菌重组菌株发酵效价。过表达菌株为过表达idi基因的类球红细菌重组菌株；对照菌株为类球红细菌JDW-610。图4为类球红细菌高产菌株pBBR1MCSK-rs4253质粒的电转化验证。泳道1为DNA分子标准；泳道2-23为不同转化子；C为质粒pBBR1MCSK-rs4253。图5为类球红细菌野生型菌株pBBR1MCSK-idi质粒的电转化验证。泳道1为DNA分子标准；泳道2-7为不同转化子；阳性克隆的PCR产物的理论值同图2。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中的Milli-Q超纯水、10％甘油为高温高压灭菌后备用；若干只50-mL玻璃试管、牙签、枪头(1mL、200μL)均为高温高压灭菌后干燥备用。下述实施例中的PYG培养基由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其浓度如下：Glucose1g/L，Tryptone10g/L，YeastExtract5g/L，pH7.2。下述实施例中的种子培养基和发酵培养基配方均为：葡萄糖20g，硫酸铵5g，味精5g，玉米浆粉7g，硫酸镁7g，磷酸二氢钾0.3g，氯化钠3g，硫酸亚铁2g，硫酸锰0.4g，氯化钴0.008g，水1L，pH6.5。下述实施例中的类球红细菌JDW-610的分类命名为类球红细菌Rhodobactersphaeroides，该菌株于2010年2月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCCNo.4497。在授权公告号为CN102154182B的专利“一种辅酶Q10生产的固料母种发酵培养的方法”中公开过。实施例1、类球红细菌高产菌株JDW-610的转化方法(重组质粒pBBR1MCSK-idi)一、重组质粒的构建将pBBR1MCS载体(派瑞金(北京)生物科技有限公司，货号：014891515)中的氯霉素抗性基因替换为卡那霉素抗性基因，且将序列1所示的DNA片段插入pBBR1MCS载体的KpnI和SacI多克隆位点间，得到重组质粒pBBR1MCSK-idi。序列1所示的DNA片段依次由启动子、RBS、类球红细菌idi基因和终止子组成。其中，类球红细菌idi基因为序列1第298-831位。二、类球红细菌高产菌株JDW-610的电转化方法1、类球红细菌高产菌株JDW-610感受态细胞的制备(1)从平板上挑取一个JDW-610菌株的菌落至5mL新鲜PYG培养基中，在32℃，220rpm摇箱中培养，直至对数生长期。(2)以适当比例转接对数期的菌液至10mL新鲜P本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种类球红细菌的转化方法，包括如下步骤：(1)将类球红细菌接种于培养基中进行培养，收集菌体；将所述菌体依次进行洗涤和重悬后，得到类球红细菌感受态细胞；所述类球红细菌感受态细胞的OD值为7.7‑9.3；(2)将外源质粒与所述类球红细菌感受态细胞混合，得到细胞混合物，将所述细胞混合物进行电击转化，得到重组菌。

【技术特征摘要】
1.一种类球红细菌的转化方法，包括如下步骤：(1)将类球红细菌接种于培养基中进行培养，收集菌体；将所述菌体依次进行洗涤和重悬后，得到类球红细菌感受态细胞；所述类球红细菌感受态细胞的OD值为7.7-9.3；(2)将外源质粒与所述类球红细菌感受态细胞混合，得到细胞混合物，将所述细胞混合物进行电击转化，得到重组菌。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述外源质粒与所述类球红细菌感受态细胞的配比为1ng：(0.75-1.50)μL。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述培养的方法为将类球红细菌株接种于培养基中培养至OD值为0.58-0.70。4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述电击转化的电压为(0.8-1.8)kv；或，所述电击转化的时间为5ms。5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张立新，徐峥，陈必钦，谭高翼，苗靳，朱志春，戴昌华，钟锦潮，王霄凤，
申请(专利权)人：华东理工大学，内蒙古金达威药业有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31