本发明专利技术涉及一种用于鹅源性检测的实时荧光定量PCR试剂盒，包括PCR反应液、酶混合液、鹅源性D‑loop基因标准品、阴性对照品和阳性对照品。本发明专利技术通过提取待检测样品的DNA结合实时荧光定量PCR检测技术，可达到准确定量待测牛羊猪肉中鹅源性含量的目的，具有快速、灵敏、特异性好的特点，对判断牛羊猪肉中鹅源性含量具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
一种用于鹅源性检测的实时荧光定量PCR试剂盒
本专利技术涉及食品检测
，尤其涉及一种用于鹅源性检测的实时荧光定量PCR试剂盒。
技术介绍
随着经济的高速发展，人民的消费需求增长，我国肉类产量逐年增加，其中鹅肉产量占据肉类总产量的13.97%。与此同时，消费者对食品质量与安全性的要求也越来越高，其中掺杂使假不法行为是消费者长期关注的焦点之一。不法商贩、企业为获得非法利润，常以较低价的鹅肉冒充牛、羊、猪肉，严重侵害了消费者利益。这不仅涉及经济、营养价值和食品安全等问题，更直接影响消费者的健康，尤其是对某些食物过敏的消费者。为维护广大消费者合法权益，稳定市场秩序，对动物性食品进行种源的鉴定显得十分必要。由于食品种类繁多、成分复杂、加工程度高等因素，使得常规检测方法如电泳、免疫学技术、光谱技术在种源的定性检测方面多有不足，如灵敏度低、周期长、费时费力。而实时荧光聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）技术以DNA为模板，设计特异引物探针，在封闭的体系中进行扩增和实时检测，无需电泳就可以对结果进行分析，避免了PCR产物的污染和溴化乙锭（ethidiumbromide，EB）带来的危害，也缩短了检测时间；且扩增目的片段较短，尤其适用于加工食品。利用实时荧光PCR技术建立肉食品中鹅源成分检测方法，可为质检部门打击不法商贩的食品掺假、造假行为、维护消费者合法利益提供有力的技术参考。实时荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。在试验中使用了探针检测，随着PCR反应的进行，当合成的新链移动到探针结合位置时，Taq酶将探针切断，探针的完整性遭到破坏，荧光报告基团的荧光信号被释放出来。模板每复制一次，就有一个探针被切断，同时伴有一个荧光信号的释放。产物与荧光信号产生一对一的对应关系，随着产物的增加，荧光信号不断增强，从而对整个PCR反应过程进行实时和动态的监测分析。动物的线粒体DNA具有分子量小、结构保守、热稳定性好、不易降解的结构特点和母系遗传、拷贝数多、进化速度快、不发生重组的遗传特点，对线粒体DNA的序列分析所提供的信息已广泛应用于研究物种之间和物种内部的系统进化分析、动物源性成分鉴定等领域。几乎所有家畜mtDNA的大小约在16.0~16.5kb之间。位于线粒体内的D-loop又称控制区，位于tRNA-Pro和Trna-Phe基因之间，长度在1kbp左右。D-loop又可分为3部分，两端是两个高变区，进化速度快；位于两个高变区之间的部分由于包含了数个保守序列而被称为中间保守域。另外不同种类的动物线粒体基因组序列虽然高度同源，存在高度保守序列，但也存在一定的变异区域，D-loop区段内的编码部分，利用此区域可设计特异性引物，很适合于动物源性的分析。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种快速、灵敏、特异性好的用于鹅源性检测的实时荧光定量PCR试剂盒。为解决上述问题，本专利技术所述的一种用于鹅源性检测的实时荧光定量PCR试剂盒，包括—PCR反应液，由12mMTris-HCl（pH8.9）、100mMKCl、0.12%TritonX-100、0.12%胆酸钠、0.6mg/mLBSA、1.8mMMgCl2、50nMdNTP、500nM上游引物、500nM下游引物、300nMTaqman探针组成；其中上游引物序列为5’-TCGCGGCATGTTCCAGC-3’；下游引物序列为5’-GGACCCTTGAAATATAG-3’；探针序列为5’-TTTTGGCGCCTCTGGTTC-3’；—酶混合液，由5U/µLTaqDNA聚合酶，50%甘油，20mMTris-HCl(pH8.0,25℃)，100mMKCl，0.1mMEDTA，1mMDTT，0.5%Tween®20和0.5%NP-40组成；—鹅源性D-loop基因标准品，由1.00×107copies/ml、1.00×106copies/ml、1.00×105copies/ml、1.00×104copies/ml的重组质粒组成；其中D-loop基因标准品序列为5’-TCGCGGCATGTTCCAGCTTTTTGGCGCCTCTGGTTCCTTTTCTCTTTTCCGGGGTTACCTCACAGGTGGCTATTCCCAGTGATCTCGGGGGTCCCACAATCTAAGCCTGGACACACCTGCCTCACGGCCTATCCTATATTTCAAGGGTCC-3’；—阴性对照品，由水组成；—阳性对照品，由1.00×107copies/ml的重组质粒组成。所述探针中5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为TAMRA。本专利技术与现有技术相比具有以下优点：1、本专利技术采用基因克隆技术，将鹅源性DNA的D-loop基因种内保守片段插入到载体pMD18-T中，获得含有D-loop基因片段的重组质粒，以此作为标准品。根据鹅源性D-loop的基因片段编码基因序列设计并合成一组特异性引物和探针，优化PCR反应条件，建立以实时荧光定量聚合酶链反应为平台的检测方法，并对所建立的方法进行评估。2、本专利技术通过提取待检测样品的DNA结合实时荧光定量PCR检测技术，可达到准确定量待测牛羊猪肉中鹅源性含量的目的，对判断牛羊猪肉中鹅源性含量具有重要意义，必将在食品检测领域发挥重要作用。3、本专利技术快速、灵敏、特异性好。附图说明下面结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步详细的说明。图1为本专利技术引物和探针体系优化实验结果。a代表引物为1.6ul，探针为1.6ul；b代表引物为1.0ul，探针为1.6ul；c代表引物为1.0ul，探针为0.8ul；d代表引物为2.0ul，探针为0.8ul；e代表引物为1.6ul，探针为0.8ul；f代表引物为2.0ul，探针为1.0ul；g代表引物为1.0ul，探针为0.8ul；h代表引物为1.0ul，探针为1.0ul；i代表引物为2.0ul，探针为1.6ul。图2为本专利技术灵敏度实验结果。a代表质粒浓度为1.00×107copies/ml、b代表质粒浓度为1.00×106copies/ml、c代表质粒浓度为1.00×105copies/ml、d代表质粒浓度为1.00×104copies/ml、e代表质粒浓度为1.00×103copies/ml、f代表质粒浓度为1.00×102copies/ml和阴性对照。图3为本专利技术特异性实验结果。其中出现标准扩增曲线的为鹅，未出现标准扩增曲线的为猪、牛、狗、鱼、羊、鸭、鸡、兔、驴、蛙、鼠、阴性对照。图4为本专利技术鹅源性标准曲线。具体实施方式一种用于鹅源性检测的实时荧光定量PCR试剂盒，包括—PCR反应液，由12mMTris-HCl（pH8.9）、100mMKCl、0.12%TritonX-100、0.12%胆酸钠、0.6mg/mLBSA、1.8mMMgCl2、50nMdNTP、500nM上游引物、500nM下游引物、300nMTaqman探针组成；其中上游引物序列为5’-TCGCGGCATGTTCCAGC-3’；下游引物序列为5’-GGACCCTTGAAATATAG-3’；探针序列为5’-TTTTGGCG本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于鹅源性检测的实时荧光定量PCR试剂盒，包括—PCR反应液，由12mM Tris‑HCl、100mM KCl、0.12%Triton X‑100、0.12% 胆酸钠、0.6 mg/mL BSA、1.8mM MgCl2、50nM dNTP、500nM 上游引物、500nM 下游引物、300nM Taqman探针组成； 其中上游引物序列为5’‑TCGCGGCATGTTCCAGC‑3’；下游引物序列为5’‑ GGACCCTTGAAATATAG‑3’；探针序列为5’‑TTTTGGCGCCTCTGGTTC ‑3’；—酶混合液，由5U/µL Taq DNA聚合酶，50%甘油，20mM Tris‑HCl，100mM KCl，0.1mM EDTA，1mM DTT，0.5% Tween®20和0.5% NP‑40组成；—鹅源性D‑loop基因标准品，由1.00×107copies/ml、1.00×106copies/ml、1.00×105copies/ml、1.00×104copies/ml的重组质粒组成；其中D‑loop基因标准品序列为5’‑TCGCGGCATGTTCCAGCTTTTTGGCGCCTCTGGTTCCTTTTCTCTTTTCCGGGGTTACCTCACAGGTGGCTATTCCCAGTGATCTCGGGGGTCCCACAATCTAAGCCTGGACACACCTGCCTCACGGCCTATCCTATATTTCAAGGGTCC‑3’；—阴性对照品，由水组成；—阳性对照品，由1.00×107copies/ml的重组质粒组成。...
【技术特征摘要】
2017.12.01 CN 201711252387X1.一种用于鹅源性检测的实时荧光定量PCR试剂盒，包括—PCR反应液，由12mMTris-HCl、100mMKCl、0.12%TritonX-100、0.12%胆酸钠、0.6mg/mLBSA、1.8mMMgCl2、50nMdNTP、500nM上游引物、500nM下游引物、300nMTaqman探针组成；其中上游引物序列为5’-TCGCGGCATGTTCCAGC-3’；下游引物序列为5’-GGACCCTTGAAATATAG-3’；探针序列为5’-TTTTGGCGCCTCTGGTTC-3’；—酶混合液，由5U/µLTaqDNA聚合酶，50%甘油，20mMTris-HCl，100mMKCl，0.1mMEDTA，1mMDTT，0.5%Tween®20和0.5%NP-40组成；—...
【专利技术属性】
技术研发人员：车团结，徐红，陈游，沈颂东，李亚鹏，
申请(专利权)人：苏州百源基因技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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