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一种基于黄单胞菌的穿梭质粒及其应用制造技术

技术编号:19448191 阅读:181 留言:0更新日期:2018-11-14 17:12
本发明专利技术披露了一种基于黄单胞菌的穿梭质粒及其应用。该穿梭质粒的全碱基序列如序列表中的序列1,该穿梭质粒分别具有在黄单胞菌和大肠杆菌中的复制起始区,并具有抗性筛选标记和多克隆位点。该穿梭质粒具有的抗性筛选标记为庆大霉素抗性筛选标记,具有庆大霉素抗性筛选标记的基因如序列表6。该穿梭质粒的应用包括在黄单胞菌胞外多糖相关基因功能鉴定中的应用。

【技术实现步骤摘要】
一种基于黄单胞菌的穿梭质粒及其应用
本专利技术涉及生物
里穿梭质粒及其应用,尤其涉及一个基于黄单胞菌的穿梭质粒及其应用。
技术介绍
黄单胞菌是一类直杆状、无芽孢、严格好气的革兰氏阴性细菌。黄单胞菌属(Xanthomonas)亦称黄单胞杆菌属,大部分成员是植物病原菌,其引起的植物病害已遍布全世界,造成了严重的经济损失。其中包括十字花科植物黑腐病、水稻白叶枯病、水稻条斑病、甘蔗细条病、柑桔溃疡病、禾谷黑颖病和棉花角斑病等,病害症状多为叶斑、叶枯、黑腐、萎蔫、溃疡等。另外,黄单胞菌均能合成胞外多糖,其中野油菜黄单胞菌合成的胞外多糖品质最好,被称为黄原胶,具有特殊的理化特性,已广泛用于工业原料、添加剂和石油开采。因此,深入研究黄单胞菌的致病分子机理和胞外多糖生物合成的分子机理,可为人们发展新型的防治植物病害的药物和采取必要的措施以及改良黄原胶生产菌株提供指导。研究黄单胞菌的致病机理,或者研究黄原胶合成机理,首先需要弄清相关基因的功能。途径之一是使目的基因在特定的条件下得到扩增和表达。然而,由于目的基因本身无法进行复制和表达,且不易进入受体细胞以及不能得到稳定维持,故必须借助于载体及其宿主细胞来实现其扩增和表达。质粒是独立于染色体以外的能自主复制的裸露的双链环状DNA分子,少数为线形和核糖核酸(RNA,RibonucleicAcid),是基因克隆、表达的主要载体之一。而质粒具有宿主专一性、不亲和性、严紧型和松弛型等特点,这对人们有效利用质粒载体造成了一定程度的不便。另外,质粒稳定复制以及质粒丢失问题,也是应用质粒载体的问题之一。在黄单胞菌中,目前常用的质粒包括pLAFR系列质粒、pBAD系列质粒、pPH1JI、pKEB31以及pUFR034等。有些质粒偏大,有些是专门化的载体,不能满足黄单胞菌功能基因组学发展的需要。未来亟需具有不同拷贝数、亲和型、稳定复制以及不易丢失的穿梭质粒,用于在大肠杆菌中扩增和表达基因,并应用在黄单胞菌中进行基因功能互补等方面的研究。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种基于黄单胞菌的穿梭质粒及其应用,能够便于应用于基因的扩增及表达。为了解决上述技术问题,本专利技术提供了一种基于黄单胞菌的穿梭质粒,该穿梭质粒的全碱基序列如序列表中的序列1,该穿梭质粒分别具有在黄单胞菌和大肠杆菌中的复制起始区,并具有抗性筛选标记和多克隆位点。优选地,该穿梭质粒在黄单胞菌中的复制起始区如序列表2,该穿梭质粒在大肠杆菌中的复制起始区如序列表3。优选地,该穿梭质粒具有的抗性筛选标记为庆大霉素抗性筛选标记,具有庆大霉素抗性筛选标记的基因如序列表6。为了解决上述技术问题,本专利技术提供了一种如前所述的穿梭质粒的应用,包括该穿梭质粒在黄单胞菌胞外多糖相关基因功能鉴定中的应用。为了解决上述技术问题,本专利技术提供了一种基于黄单胞菌的穿梭质粒的构建方法,包括:从水稻条斑病菌GX01菌株中提取内生质粒pXOCgx01;将R6Kγori/KAN-2(EZ-Tn5)序列插入所述内生质粒pXOCgx01,获得能够复制在大肠杆菌EC100Dpir+中并具有卡那霉素抗性的质粒系列pXTR-PT1~pXTR-PT4;分别将所述质粒系列pXTR-PT1~pXTR-PT4导入野油菜黄单胞菌8004菌株中,进行DNA剪切、重组,并从pXTR-PT4的转化子中获得穿梭质粒中间体pXTR14k;对所述中间体pXTR14k进行定点修饰,添加多克隆位点、切除部分冗余序列、替换抗性筛选标记,最终获得可用的具有庆大霉素抗性筛选标记的穿梭质粒pXUG。依照本专利技术的方法构建获得的穿梭质粒pXUG、pXUK具有拷贝数清楚、亲和性好、稳定复制且不易丢失的特点,为黄单胞菌穿梭质粒的制备及应用提供了新的途径,也为黄单胞菌基因功能的研究提供了有力的载体工具。附图说明图1为水稻条斑病菌GX01菌株内生质粒pXOCgx01的酶切验证电泳图;图2为本专利技术提取的pXTR-PT1~pXTR-PT4系列质粒的BamHI酶切电泳图;图3为本专利技术将pXTR-PT1~pXTR-PT4系列质粒进行DNA重组获取的穿梭质粒中间体pXTR14k的图谱;图4为本专利技术将穿梭质粒中间体pXTR14k与质粒pUC19-2连接得到重组质粒pGUC2的图谱;图5为本专利技术最终获取的具有庆大霉素抗性筛选标记的穿梭质粒pXUG的图谱;图6为本专利技术最终获取的具有卡那霉素抗性筛选标记的穿梭质粒pXUK的图谱;图7为本专利技术获取的穿梭质粒pXUG表达胞外多糖相关基因功能互补结果图;图8为本专利技术获取的穿梭质粒pXUK表达胞外蛋白酶相关基因功能互补结果图。具体实施方式以下结合附图和优选实施例对本专利技术的技术方案进行详细地阐述。应该理解,以下列举的实施例仅用于说明和解释本专利技术,而不构成对本专利技术技术方案的限制。本专利技术提供的穿梭质粒的碱基序列如序列表中的序列1,该穿梭质粒具有分别在黄单胞菌和大肠杆菌中复制的复制起始区,并具有抗性筛选标记和多克隆位点。该穿梭质粒在黄单胞菌中的复制起始区如序列表2,该穿梭质粒在大肠杆菌中的复制起始区如序列表3。穿梭质粒具有庆大霉素抗性筛选标记的基因如序列表6,穿梭质粒具有卡那霉素抗性筛选标记的基因如序列表7。本专利技术提供的穿梭质粒获取的方法如下:1)从水稻条斑病菌GX01菌株中提取内生质粒pXOCgx01;2)将R6Kγori/KAN-2(EZ-Tn5)序列插入pXOCgx01,获得能够复制在大肠杆菌EC100Dpir+中并具有卡那霉素抗性的质粒系列pXTR-PT1~PT4;3)分别将质粒系列pXTR-PT1~PT4导入野油菜黄单胞菌8004菌株中,进行DNA剪切、重组,从pXTR-PT4的转化子中获得穿梭质粒中间体pXTR14k;4)对中间体pXTR14k进行定点修饰,添加多克隆位点、切除部分冗余序列、替换抗性筛选标记,最终获得可用的穿梭质粒pXUG、pXUK。本专利技术获取的穿梭质粒载体pXUG、pXUK在黄单胞菌基因功能鉴定中的应用。在本专利技术如下的实施例中所用到的材料包括:原始质粒pXOCgx01序列公布在美国国立生物技术信息中心GenBank数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/),序列号为:KR071788.1。大肠杆菌(Escherichiacoli)株系EC100Dpir+和EZ-Tn5TM<R6Kγori/KAN-2>试剂盒,购自EpicentreBiotechnologies;水稻条斑病菌GX01菌株和野油菜黄单胞菌8004菌株,为广西大学生命科学与技术学院植物病原细菌功能基因组学实验室保存;限制性内切酶、修饰酶等试剂,购自Promega、TAKARA、QIAGEN公司;抗生素利福平、卡那霉素和培养基原料:蛋白胨、酵母提取粉及甘油,购于上海生物工程公司。常规实验方法参见分子克隆实验指南(第三版,J.萨姆布鲁克等著)。实施例1从水稻条斑病菌GX01菌株中提取内生质粒pXOCgx01采用常规的质粒提取法从水稻条斑病菌GX01菌株中提取内生质粒pXOCgx01,该质粒已经完成全质粒测序(发表论文作参考),酶切验证电泳图见图1,与电子酶切吻合,确认该质粒是提取的内生质粒pXOCgx01。在图1中:A为直接从XocGX01中提取的染色体外D本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种基于黄单胞菌的穿梭质粒,其特征在于,该穿梭质粒的全碱基序列如序列表中的序列1,该穿梭质粒分别具有在黄单胞菌和大肠杆菌中的复制起始区,并具有抗性筛选标记和多克隆位点。

【技术特征摘要】
1.一种基于黄单胞菌的穿梭质粒,其特征在于,该穿梭质粒的全碱基序列如序列表中的序列1,该穿梭质粒分别具有在黄单胞菌和大肠杆菌中的复制起始区,并具有抗性筛选标记和多克隆位点。2.按照权利要求1所述的穿梭质粒,其特征在于,所述穿梭质粒在黄单胞菌中的复制起始区如序列表2,所述穿梭质粒在大肠杆菌中的复制起始区如序列表3。3.按照权利要求1所述的穿梭质粒,其特征在于,所述穿梭质粒具有的抗性筛选标记为庆大霉素抗性筛选标记,具有庆大霉素抗性筛选标记的基因如序列表6。4.一种如权利要求1所述的穿梭质粒的应用,其特征在于,包括该穿梭质粒在黄单胞菌胞外多糖相关基因功能鉴定中的应用。5.一种基于黄单胞菌的穿...

【专利技术属性】
技术研发人员:何勇强李康佳牛祥娜唐纪良姜伟朱平川许力丹赵敏
申请(专利权)人:广西大学
类型:发明
国别省市:广西,45

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