一种极性氨基酸高产菌株的筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种筛选极性氨基酸高产菌株的筛选方法。本发明专利技术所提供的筛选方法是按照包括以下步骤进行：在所筛选的微生物中确定极性氨基酸对应密码子使用频率，选择能够在所筛菌株中表达新的抗性或表型性状的基因作为筛选标记，将其核酸序列中某一极性氨基酸的所有密码子替换为稀有密码子，人工合成筛选基因并连接至筛选质粒上。在人工诱变等方法得到微生物的突变库中转化入筛选质粒，通过检测筛选基因的表达水平，可以从突变菌株中挑选出高产极性氨基酸的菌株。本发明专利技术利用生物对密码子的偏好性，实现了对高产极性氨基酸菌株的筛选，并成功在大肠杆菌中分别筛选出高产L‑精氨酸和L‑丝氨酸的突变菌株。

【技术实现步骤摘要】
一种极性氨基酸高产菌株的筛选方法
本专利技术涉及一种极性氨基酸高产菌株的筛选方法，属于生物工程

技术介绍
极性氨基酸是按照侧链基团极性所划分出的一类氨基酸，包括L-甘氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-半胱氨酸、L-酪氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺、L-精氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸、L-天冬氨酸和L-谷氨酸，又称为亲水氨基酸。极性氨基酸在食品和医药方面有广泛的应用，L-苏氨酸可以缓解疲劳，促进生长发育；L-半胱氨酸加入果汁中以防止维生素C氧化和褐变；L-赖氨酸是人体生酮氨基酸之一，可以促进钙吸收，改善睡眠，提高记忆力，是第一限制性氨基酸。目前，微生物发酵生产极性氨基酸仍有大片空白，迫切需要性状优秀的氨基酸高产菌株。传统的筛选方法是使用氨基酸类似物进行反复筛选得到，比如L-丝氨酸和L-精氨酸对应的异羟肟酸可以作为其类似物，用于筛选L-丝氨酸和L-精氨酸的高产菌株。但是，依赖氨基酸类似物的筛选方式会受限于氨基酸类似物种类、转运能力和细胞外排能力的影响，须多轮重复筛选才能得到真正的氨基酸高产菌株。使用密码子进行氨基酸高产菌株的筛选拥有诸多优势。首先，用基因替代氨基酸类似物，针对不同物种优化序列，可筛选的物种数量远大于氨基酸类似物的适用范围。其次，稀有密码子对氨基酸高产菌株的筛选压力只作用于含有此密码子的基因中，不会干扰到其他基因的表达和影响菌体的正常生长；而氨基酸类似物不仅会随机插入到肽链中，而且会抑制嘌呤、嘧啶和ATP的生物合成，对菌体有明显的毒性作用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种从自然界或人工突变库中筛选氨基酸高产菌株的方法，利用密码子偏好性和tRNA氨酰化水平的差异，简单有效的从众多菌株中分离出对应的氨基酸高产菌株，最终通过摇瓶发酵实验确定菌株的最终氨基酸产量，为氨基酸高产菌株的筛选方式提供新的方法(如图1)。按照本专利技术提供的技术方案，一种氨基酸高产菌株的筛选方法，采用以下方法步骤：1.分析大肠杆菌(Escherichiacoli)和谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)中L-甘氨酸，L-丝氨酸，L-苏氨酸，L-半胱氨酸，L-酪氨酸，L-天冬酰胺，L-谷氨酰胺、L-精氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸、L-天冬氨酸和L-谷氨酸的密码子偏好性，据所筛选的氨基酸和菌种选择对应的稀有密码子。2.确定筛选基因，并将筛选基因中一种极性氨基酸的密码子替换为步骤1中确定的稀有密码子，并人工合成此序列。3.将步骤2中人工合成的筛选基因序列与质粒载体连接，将连接产物化转至大肠杆菌中，经过PCR验证，挑选正确的单菌落，提取得到筛选质粒。4.将进行筛选的菌株制备感受态，将步骤3中得到的质粒使用电转至菌株感受态中，涂于平板上培养。5.将步骤4中转化得到的单菌落逐个转接到筛选培养基中，使用96孔板进行培养10小时－24小时或10小时或16小时或24小时。通过测定筛选基因的表达量或挑取菌体特征最明显的菌株作为氨基酸高产菌株。6.将得到的氨基酸高产菌株在发酵培养基中进行发酵验证。筛选培养基组成：胰蛋白胨0.5－20g/L，酵母粉0.5－20g/L，氯化钠0.5－20g/L。发酵培养基组成：磷酸盐5－20g/L，氯化铵1－5g/L，葡萄糖1－5g/L，氯化钠0.1－10g/L，硫酸镁0.3g/L，氯化钙0.015g/L，维生素B15－50μg/L。附图说明图1为使用稀有密码子筛选极性氨基酸高产菌株的原理；图2为使用稀有密码子筛选出的L-精氨酸高产菌株的发酵结果；图3为使用稀有密码子筛出的L-丝氨酸高产菌株的发酵结果。具体实施方式下述实例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业突进获取。以下实施例是对本专利技术的进一步说明，并不构成对本专利技术实质内容的限制。实施例1、利用稀有密码子筛选L-精氨酸高产菌株(1)以大肠杆菌DH5α(购于北京博迈德基因技术有限公司)为筛选菌株，大肠杆菌DH5α在翻译过程中使用的L-精氨酸密码子共有六种，分别是CGG，CGU，CGA，CGC，AGG和AGA，其中密码子AGG的使用频率最低(记载大肠杆菌密码子偏好性的非专利文献为DongH,NilssonL,KurlandCG.,1996，Co-variationoftRNAabundanceandcodonusageinEscherichiacoliatdifferentgrowthrates.Journalofmolecularbiology,260(5):649-663.)，因此可以用于精氨酸高产菌株筛选。将卡那霉素基因Kan中的8个精氨酸对应的密码子全部替换为稀有密码子AGG。采用基因全合成的方法得到序列1所示的卡那霉素基因。(2)基因全合成体系为：5×FastPfuFlyBuffer10μL，dNTP(2.5mM)4μL，引物预混液2μL，FastPfuFlyDNAPolymerase1μL,蒸馏水35μL，总体积为50μL。扩增条件为95℃变性20秒、55℃退火20秒、72℃延伸20秒(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。扩增产物包含卡那霉素基因Kan，并将其连接到pAKR载体骨架上。连接体系：1.5μLPCR扩增产物、1μLpAKR载体片段，7.5μLGibsonMasterMix(购自NEWENGLANDBioLabs)，轻轻混合，50℃水浴反应60分钟。随后加入50μLDH5α感受态细胞中(购于北京博迈德基因技术有限公司)，冰浴30分钟，42℃热激30秒，立刻置于冰上2分钟。加入250μLSOC培养基，于37℃、200rpm摇床中震荡培养1小时。因为pAKR骨架含有氨苄青霉素抗性基因Amp，取200μL菌液涂于含有氨苄青霉素的LB平板上，过夜培养。待LB平板上长出单菌落后，经PCR测序验证后将阳性克隆进行液体培养，提取质粒进行测序验证。测序结果表明载体pAKR成功插入了新合成的卡那霉素基因Kan，证明质粒构建正确，将得到的重组质粒命名为pAKR-RC。通过紫外、亚硝基胍或者常温常压等离子诱变系统对DH5α进行诱变处理，将处理后的菌液转接至2mLLB培养基中。经37℃、200rpm培养3－5小时直到OD600到0.4－0.6，将菌液置于冰上15－30分钟，随后在4℃、4000×g下离心10分钟，弃去上清，用500μL无菌冰水重悬细胞,再次于4℃、4000×g离心10分钟，小心弃去上清。用20％甘油溶液重悬细胞至50μL。电转条件：将50μL制备好的感受态细胞置于冰上，加入1μL载体pAKR-RC，于冰上放置10分钟后，转至0.2cmBio-Red电转杯。使用GenePulserXcellTM电穿孔系统(Bio-Red公司)，电击电压为2.5kV。电击后立刻用500μLLB培养基冲洗电转杯，轻微吹吸5次后转移至试管中，37℃、200rpm培养半小时，将菌液涂于含有卡那霉素和氨苄青霉素的LB平板上，37℃过夜培养后，得到含有pAKR-RC质粒的突变菌库。从平板上挑取单克隆，转接至含有1.5mL筛选培养基的96深孔板中，37℃、200rpm培养12－24小时后，于600nm波长处测定菌液的吸光值，挑选吸光值最高的10株菌作为可能的L-精氨本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用稀有密码子筛选极性氨基酸高产菌株的方法，其特征是分析微生物对密码子的偏好性，通过导入经稀有密码子替换的外源基因，实现对极性氨基酸高产菌株的筛选作用。

【技术特征摘要】
2018.03.05 CN 20181018043761.一种利用稀有密码子筛选极性氨基酸高产菌株的方法，其特征是分析微生物对密码子的偏好性，通过导入经稀有密码子替换的外源基因，实现对极性氨基酸高产菌株的筛选作用。2.根据权利要求所述一种利用稀有密码子筛选氨基酸高产菌株的方法，其特征在于采用如下步骤：A.分析微生物菌株对甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸、赖氨酸、组氨酸、天冬氨酸和谷氨酸氨酸密码子的偏好性，确定特定其翻译极性氨基酸对应的稀有密码子；B.根据微生物菌株的生长特性，选择合适的筛选基因，包括但不限于抗生素抗性基因、可检测的荧光蛋白、造成菌体死亡的致死基因和影响菌落颜色、形态的基因；C.根据所筛微生物菌株对氨基酸密码子的偏好性，将筛选基因中甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸、赖氨酸、组氨酸、天冬氨酸或谷氨酸氨酸的密码子替换为对应的稀有密码子，并人工合成筛选基因序列。D.将步骤C中人工合成的筛选基因序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：霍毅欣，王宁，郑博，马晓焉，
申请(专利权)人：北京理工大学，
类型：发明
国别省市：北京,11