肾癌预后新型分子标志物非编码RNA LINC00668的应用、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术涉及一种肾癌预后新型分子标志物非编码RNA LINC00668的应用、试剂盒及检测方法，通过实时荧光定量PCR与生存曲线分析发现肾癌组织来源的非编码RNA LINC00668与患者的生存率相关，含量越高，生存率越高，此法为预测肾癌患者的预后生存期分析提供了强有力的技术支持，有助于提高肾癌患者的术后生活质量，制订术后治疗方案，提高生存率，具有深远的临床意义。

【技术实现步骤摘要】
肾癌预后新型分子标志物非编码RNALINC00668的应用、试剂盒及检测方法
本专利技术属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及一种肾癌预后新型分子标志物非编码RNALINC00668的应用、试剂盒及检测方法。
技术介绍
肾细胞癌是成人泌尿生殖系统中一种肿瘤，发病率比较高，约占恶性肿瘤的3％，病死率也高达40％。在我国，肾癌是成人泌尿生殖系统中发病率位居第二的恶性肿瘤，统计结果显示，每年每十万人中大约有38个男性和17个女性被诊断为肾癌。肾癌最早来源于近端肾小管上皮细胞，发病率最高的病理类型是肾透明细胞癌。肾癌容易发生转移，大约有30％的局限性肾癌患者都会发生转移。'转移性肾癌的预后更差，生存期约为6—12个月，5年生存率小于10％。肾癌缺乏用于早期诊断的肿瘤标记物，发现时多为中晚期患者，大约有30%的患者在确诊时己发生转移，而且肾癌对放疗和化疗都不敏感。所以，寻找新的预后生物标志物是目前急需解决的问题。人类基因组中只有不到2％的序列为蛋白质编码，其他序列虽然不编码蛋白质，但超过90％能被转录成RNA。这些不能为蛋白质编码的RNA分子统称为非编码RNA。非编码RNA参与了多种生物学过程，并在肿瘤发生发展中发挥重要作用。非编码RNA基于规模大致分为两大类：短链非编码RNA和长链非编码RNA。作为非编码RNA中的新角色，长链非编码RNA在各种疾病尤其是肿瘤中起重要调控作用，成为肿瘤研究的热点。长链非编码RNA在多种层面上调控基因的表达即(表观遗传水平、转录水平及转录后调水平等。大量证据表明多种长链非编码RNA在多类肿瘤中存在异常表达，在肿瘤的发生、发展过程中发挥着促癌或抑癌作用。LINC00668是一种新发现的非编码RNA，其转录本长度大于200个核苷酸。目前，LINC00668在正常细胞发育或肿瘤发生发展的过程中发挥的重要作用还在进一步研究中。LINC00668是否可以作为一种新的肿瘤标志物用于预测肾癌患者预后尚未有报道。因此，我们首次阐明了以LINC00668为新的肾癌标志物来预测患者预后的可行性。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种肾癌预后新型分子标志物非编码RNALINC00668的应用，其次，本专利技术提供一种检测标志物非编码RNALINC00668在肾癌组织中表达量的试剂盒及检测方法。本专利技术的目的是这样实现的：肾癌预后新型分子标志物非编码RNALINC00668在制备预测肾癌患者预后的制剂的应用，该非编码RNALINC00668的核酸序列如SEQNO:1所示。所述的用于预测肾癌患者预后的制剂为实时荧光定量PCR检测试剂盒。试剂盒包括用于检测非编码RNALINC00668表达的特异性引物，所述特异性引物的核酸序列为SEQNO:2和SEQNO:3，以及内参基因TUBA1A表达的引物序列，所述引物的核酸序列为SEQNO:4和SEQNO:5。试剂盒还含有从组织中提取RNA并进行逆转录及实时荧光定量PCR的所有试剂，包括(1)从肾癌的肿瘤或正常对照组织中抽提总RNA所用试剂，包括Trizol液、氯仿、异丙醇、抑制RNA降解溶剂、75％乙醇，DEPC水；(2)以总RNA为模板将非编码RNALINC00668逆转录为cDNA所用试剂，包括逆转录反应缓冲液、含有含Mg2+的三磷酸碱基脱氧核苷酸dNTP、逆转录酶M-MLV以及随机引物和OligodT引物的混合物；(3)将cDNA实时荧光定量PCR所用试剂，包括LINC00668实时荧光定量PCR特异性引物、TUBA1A内参特异性PCR引物、实时荧光定量SYBR染料、无RNA酶的水。肾癌预后新型分子标志物非编码RNALINC00668的检测方法，包括以下步骤：1）收集待测肾癌或正常对照组织；2)组织中RNA的抽提；3）LINC00668RNA的逆转录，以细胞总RNA为模板，逆转录得到cDNA；4）以cDNA为模板，利用非编码RNALINC00668的特异性引物进行实时荧光定量PCR扩增，检测非编码RNALINC00668表达量。步骤3）中逆转录反应体系为5×RTBuffer（含Mg2+和dNTP）4μl，10×RTPrimerMix（OligodTPrimer和RandomHexamers混合物）2μl，BeyoRT™IIM-MLV逆转录酶(RNaseH-)（含RNaseInhibitor）2μl，DEPC-treatedwater2μl，去除gDNA后的TotalRNA10μl。步骤4）中检测标志物非编码RNALINC00668的表达量用相对定量方法。本专利技术的有益效果是：通过实时荧光定量PCR与生存曲线分析发现肾癌组织来源的非编码RNALINC00668与患者的生存率相关，含量越高，生存率越高，此法为预测肾癌患者的预后生存期分析提供了强有力的技术支持，有助于提高肾癌患者的术后生活质量，制订术后治疗方案，提高生存率，具有深远的临床意义。附图说明图1为实时荧光定量PCR分析LINC00668在正常组织与肾癌中的表达差异；图2为生存曲线分析肾癌组织来源的非编码RNALINC00668表达高低对肾癌患者的预后影响。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作以下说明：实施例1：肾癌预后新型分子标志物非编码RNALINC00668在制备预测肾癌患者预后的制剂的应用，将标志物非编码RNALINC00668用于制备肾癌预后的制剂，预测肾癌患者的情况。实施例2：制备检测非编码RNALINC00668表达量的试剂用于制备肾癌患者预后的试剂盒(用于30次反应)1.Trizol20ml2.抑制RNA降解溶剂40ml；3.氯仿80ml；4.异丙醇80ml；5.DEPC水10ml；6.10×随机引物和OligodT引物的混合物100μl；7.5×逆转录反应缓冲液150μl；8.10mM含Mg2+的三磷酸碱基脱氧核苷酸dNTP100μl；9.200U/μlM-MLV逆转录酶50μl；10.SYBRGreenqPCRMix500μl；11.3μM目的基因LINC00668特异性引物（其序列如SEQNO:2和SEQNO:3所示）50μl；12.3μM内参基因TUBA1A特异性引物（其序列如SEQNO:4和SEQNO:5所示）50μl。实施例3：组织样本非编码RNALINC00668的检测1、收集待测肾癌或正常对照组织，生理盐水清洗干净后，放入盛有抑制RNA降解溶剂的冻存管中，放至-80℃冰箱备用。2、组织中RNA的抽提：（1）先在研钵中加入液氮，再将组织剪成小块在液氮中磨成粉末，用液氮预冷的药匙取100mg组织粉末加入已盛有1ml的Trizol液的EP管中，组织粉末总体积不能超过所用Trizol体积的10%，充分混合均匀；（2）室温放置5分钟，然后加入200μl的氯仿，盖紧EP管并剧烈摇荡0.5分钟，12000转/分钟离心10分钟；（3）取上层水相于一新的EP管中（勿中间的沉淀层和下层液混入），加入500μl异丙醇，温和颠倒混匀，室温放置10分钟，12000转/分钟离心10分钟。（4）小心地弃去上清液，加入1ml的75%乙醇，涡旋混匀，4℃下12000转/分钟离心5分钟，重复操作一次；（5）弃去上清液（尽量将残余液体除去），室温或真空干燥5～10分钟（注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度），用50本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.肾癌预后新型分子标志物非编码RNALINC00668 在制备预测肾癌患者预后的制剂的应用，该非编码RNA LINC00668的核酸序列如SEQ NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.肾癌预后新型分子标志物非编码RNALINC00668在制备预测肾癌患者预后的制剂的应用，该非编码RNALINC00668的核酸序列如SEQNO:1所示。2.根据权利要求1所述的肾癌预后新型分子标志物非编码RNALINC00668的应用，其特征在于：所述的用于预测肾癌患者预后的制剂为实时荧光定量PCR检测试剂盒。3.一种如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：包括用于检测非编码RNALINC00668表达的特异性引物，所述特异性引物的核酸序列为SEQNO:2和SEQNO:3，以及内参基因TUBA1A表达的引物序列，所述引物的核酸序列为SEQNO:4和SEQNO:5。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：还含有从组织中提取RNA并进行逆转录及实时荧光定量PCR的所有试剂，包括(1)从肾癌的肿瘤或正常对照组织中抽提总RNA所用试剂，包括Trizol液、氯仿、异丙醇、抑制RNA降解溶剂、75％乙醇，DEPC水；(2)以总RNA为模板将LINC00668逆转录为cDNA所用试剂，包括逆转录反应缓冲液、含有含Mg2+的三磷酸碱基脱氧核苷酸dNTP、逆转录酶M-MLV以及随机引物和OligodT引物的混合物；(3)将cDNA实时定量PCR所用试剂，包括LINC00668实时荧光定...

【专利技术属性】
技术研发人员：李兆明，
申请(专利权)人：郑州大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：河南,41