对大肠杆菌gloA基因进行定点定向突变的方法技术

本发明专利技术公开了对大肠杆菌gloA基因进行定点定向突变的方法，首先进行克隆大肠杆菌gloA基因；再构建克隆载体gloA/pSMART‑LcKan；最后构建gloA/pSMART‑LcKan质粒。本发明专利技术为了验证ZmGlyI基因的功能，排除大肠杆菌中乙二醛酶同工酶基因gloA对试验干扰，运用CRISPR/Cas9基因组编辑技术，对大肠杆菌gloA基因进行定点定向突变，使之最终在验证ZmGlyI基因的功能过程中能够被敲除。

【技术实现步骤摘要】
对大肠杆菌gloA基因进行定点定向突变的方法
本专利技术属于生物
，涉及对大肠杆菌gloA基因进行定点定向突变的方法。
技术介绍
非生物胁迫是导致农作物减产的重要原因之一，非生物胁迫可以影响植物的各种生化、生化反应，例如矿物-营养平衡、渗透压的变化、激素转导平衡、光合作用等，甚至会抑制植物的生长及发育。玉米是全世界最重要的经济作物之一，同时也是饲料、生物能源的一个重要来源，为了验证ZmGlyI基因的功能，排除大肠杆菌中乙二醛酶同工酶对试验干扰，运用CRISPR/Cas9基因组编辑技术，通过构建pTargetF-gloA和gloAΔ/pSMART-LCKan载体，对大肠杆菌gloA基因进行定点定向突变，为了提高敲除效率，在Gibson克隆技术的基础上，通过多轮PCR反应，将两个gRNA连到gloA基因两侧导入同一个入门载体中，再将入门载体与含Cas9表达框的目标载体共电击转化，最终获得gloA缺失的大肠杆菌表达菌株。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供对大肠杆菌gloA基因进行定点定向突变的方法，本专利技术为了验证ZmGlyI基因的功能，排除大肠杆菌中乙二醛酶同工酶基因gloA对试验干扰，运用CRISPR/Cas9基因组编辑技术，对大肠杆菌gloA基因进行定点定向突变，使之最终在验证ZmGlyI基因的功能过程中能够被敲除。本专利技术所采用的技术方案是按照以下步骤进行：步骤1：克隆大肠杆菌gloA基因；步骤2：构建克隆载体gloA/pSMART-LcKan；步骤3：构建gloA/pSMART-LcKan质粒。进一步，步骤1中所用引物gloA△upF：ATCAAGCTTGAATTCGTTCAGGTATCGTCAATGATTTCgloA△upR：GCAGGAGACTTTTTATCCTCAAAATGGCgloA△downF：GGATAAAAAGTCTCCTGCCGGGCGTGAACTgloA△downR：ATATCTAGAGAATTCGTCCAGCACAGCAGTGCGTTCGG。进一步，步骤2中线性化pSMART-LcKan质粒方法如下，pSmart-LcKan的ORI是pUC起源高拷贝，其中的rop基因是表达蛋白基因，采用Snapgene软件分析pSMART-LCKan载体序列，设计引物pSMARTF/R进行载体线性化，引物信息如下：pSMARTF：GACGAATTCTCTAGATATCGCTCAATACpSMARTR：AACGAATTCAAGCTTGATATCATTCAGG。进一步，步骤3构建gloA/pSMART-LcKan质粒方法如下，Gibson连接，需要在DNA片段的末端加上同源片段，然后将这些DNA片段和一种mastermix混合孵育，这种mastermix含有三种不同类型的酶：一种外切酶，从5’端开始对DNA进行消化，产生长的黏性末端，这样便于与另外的同源末端进行配对结合。一种聚合酶，用于修补gap一种DNA连接酶，实现无痕拼接，形成完整的DNA分子，Gibson连接E.coliBL21gDNAgloA△上下游序列与线性化的pSMART-LcKanPCR产物，从而构建gloA△/pSMART-LcKan。附图说明图1是pSMART-LCKan载体结构示意图。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术进行详细说明。1材料与方法1.1克隆大肠杆菌BL21(DE3)gloA△基因1.1.1引物设计引物设计软件使用NCBIblast，导入全长E.coliBL21(DE3)序列。进行blast分析引物特性后，选出符合要求的引物，并委托擎科生物技术有限公司合成。所用引物序列如下所示：gloA△upF：ATCAAGCTTGAATTCGTTCAGGTATCGTCAATGATTTCgloA△upR：GCAGGAGACTTTTTATCCTCAAAATGGCgloA△downF：GGATAAAAAGTCTCCTGCCGGGCGTGAACTgloA△downR：ATATCTAGAGAATTCGTCCAGCACAGCAGTGCGTTCGG引物的各个参数均符合要求。1.1.2BL21(DE3)gloA基因上、下游序列PCR反应体系如表1至表3所示。表1gloA△up反应体系表2gloA△down反应体系表3gloA△up/downPCR反应条件(Gadient)PCR反应程序先进行10个循环合成小片段，后20个循环将前10个循环合成的小片段再进行拼接，最终形成目的片段。用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。电泳条件为150V，20min。1.1.3PCR产物回收扩增产物按照TIANquickMidiPurificationkit普通DNA产物纯化试剂盒的使用说明进行回收(离心柱型)操作步骤如下：①柱平衡步骤：向吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管中)加入500ul的平衡液BL，12，000rpm(～13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2重新放回收集管中。(请使用当天处理过得柱子)②估计PCR反应液或酶切反应液的体积，向其中加入5倍体积的结合液PB，充分混匀。③将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管中)，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管。④向吸附柱CB2中加入600ul漂洗液PW(使用前请按说明书加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。⑤重复操作步骤4。⑥将吸附柱CB2放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱CB2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的试验。⑦将吸附柱CB2放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30-50ul洗脱缓冲液EB，室温放置2min。12,000rpm(～13,400×g)离心2min收集DNA溶液。回收产物检测：Nanodrop2000测浓度及纯度并记录数据。1.2构建克隆载体gloA△/pSMART-LcKan1.2.1线性化pSMART-LcKan质粒pSmart-LcKan的ORI是pUC起源高拷贝，其中的rop基因是表达蛋白基因，该基因降低了pSMART-LCKan质粒拷贝数，故pSMART-LCKan质粒比pUC小，拷贝数低，适合做基因克隆载体。Snapgene软件分析pSMART-LCKan载体序列，设计引物pSMARTF/R进行载体线性化并委托擎科生物科技有限公司合成引物。引物信息如下：pSMARTF：GACGAATTCTCTAGATATCGCTCAATACpSMARTR：AACGAATTCAAGCTTGATATCATTCAGG载体结构示意图见图1，表4为pSMART-LcKan质粒线性化反应体系；表4表5为pSMART-LcKan质粒线性化PCR程序。表5PCR产物凝胶电泳验证后，用普通DNA产物纯化试剂盒回收。1.2.2构建gloA△/pSMART-LcKan质粒Gibson连接，需要在DNA片段的末端加上同源片段(通过PCR法加上)然后，将这些DNA片段和一种masterm本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.对大肠杆菌gloA基因进行定点定向突变的方法，其特征在于按照以下步骤进行：步骤1：克隆大肠杆菌gloA基因；步骤2：构建克隆载体gloA/pSMART‑LcKan；步骤3：构建gloA/pSMART‑LcKan质粒。

【技术特征摘要】
1.对大肠杆菌gloA基因进行定点定向突变的方法，其特征在于按照以下步骤进行：步骤1：克隆大肠杆菌gloA基因；步骤2：构建克隆载体gloA/pSMART-LcKan；步骤3：构建gloA/pSMART-LcKan质粒。2.按照权利要求1所述对大肠杆菌gloA基因进行定点定向突变的方法，其特征在于：所述步骤1中所用引物gloA△upF：ATCAAGCTTGAATTCGTTCAGGTATCGTCAATGATTTCgloA△upR：GCAGGAGACTTTTTATCCTCAAAATGGCgloA△downF：GGATAAAAAGTCTCCTGCCGGGCGTGAACTgloA△downR：ATATCTAGAGAATTCGTCCAGCACAGCAGTGCGTTCGG。3.按照权利要求1所述对大肠杆菌gloA基因进行定点定向突变的方法，其特征在于：所述步骤2中线性化pSMART-LcKan质粒方法如下，pSmart-LcKan的ORI是pUC起源高拷贝，其中的rop基因是表达蛋白基因，...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵美爱，宋希云，孙娇，杨小英，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37