肠道病毒PCR质控品装甲RNA及制备方法技术

本发明专利技术公开了肠道病毒PCR质控品装甲RNA及制备方法，该装甲RNA的表达载体为pET32a‑MS2‑CP‑ENV‑2B质粒，该表达载体pET32a‑MS2‑CP‑ENV‑2B质粒转入大肠杆菌原核表达菌株BL21中，诱导表达，超声波破碎后，离心收集沉淀，获得肠道病毒PCR质控品装甲RNA的病毒样颗粒，其中该表达载体pET32a‑MS2‑CP‑ENV‑2B质粒中，MS2‑CP的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:1所示，ENV‑2B的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:2所示；该装甲RNA储存时不会受到RNase酶降解，是性能稳定的肠道病毒PCR质控品；该装甲RNA的制备方法操作简单、安全和有效。

【技术实现步骤摘要】
肠道病毒PCR质控品装甲RNA及制备方法
本专利技术涉及肠道病毒属病毒的检测技术，具体涉及肠道病毒PCR质控品装甲RNA及制备方法。
技术介绍
肠道病毒(Enterovirus)属于微小RNA病毒科(Picornaviridae)、肠道病毒属（Enterovir-us），已知有64种血清型会感染人体，包括脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒和一些新型肠道病毒和甲型肝炎病毒等。比如1998年台湾地区爆发了由肠道病毒71型(EV71)流行感染的手足口病和疱疹性咽呷炎，感染人数超过10万，几百人因并发脑炎、无菌性脑膜炎、肺水肿和出血、急性弛缓性麻痹和心肌炎而死亡；近年还有一些研究表明糖尿病也与肠道病毒有关。现有的肠道病毒的检测技术，以PCR技术为代表的分子生物学技术，具有快速、灵敏、成本低等优势，但核酸检测必须使用质控品进行质量控制。目前RNA病毒的质控品主要为病毒颗粒、裸露的RNA片段和装甲RNA。病毒颗粒包括减毒、灭活病毒或疫苗，目前除黄热病毒、汉坦病毒少数有减毒活疫苗其余病毒性出血热外均无疫苗。国内目前市面在售各类出血热病毒检测试剂盒一般采用合成RNA或DNA片段，RNA模板容易在环境中受到RNase酶降解。以噬菌体为基础的内嵌核酸病毒盔甲颗粒因其与全病毒颗粒最为接近，已成为标准物质研制的一个热点，如将MS2噬菌体相应cDNA序列克隆至原核表达载体并插入特定病毒序列，经转录、翻译噬菌体衣壳蛋白组装成病毒样颗粒（装甲RNA），具备RNase抗性便于存储和运输。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种肠道病毒PCR质控品装甲RNA及制备方法，该装甲RNA储存时不会受到RNase酶降解，是性能稳定的肠道病毒PCR质控品；该装甲RNA的制备方法操作简单、安全和有效。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：肠道病毒PCR质控品装甲RNA，该装甲RNA的表达载体为pET32a-MS2-CP-ENV-2B质粒，该表达载体pET32a-MS2-CP-ENV-2B质粒转入大肠杆菌原核表达菌株BL21中，诱导表达，超声波破碎后离心收集沉淀，获得肠道病毒PCR质控品装甲RNA的病毒样颗粒，其中该表达载体pET32a-MS2-CP-ENV-2B质粒中，MS2-CP的核苷酸序列为序列表中SEQIDNO:1所示，ENV-2B的核苷酸序列为序列表中SEQIDNO:2所示。肠道病毒PCR质控品装甲RNA的制备方法，其步骤如下：a.ENV-2B获得：以肠道病毒属CODEHOP引物E4559/FE4937扩增临床分离的阳性CODEHOP样本，并将扩增序列克隆至pUCm-T质粒载体中，获得目的序列片段pUCm-ENV-2B；b.噬菌体MS2-CP获得：以Genbank数据库中噬菌体MS2基因序列为基本序列，将序列递交生物公司进行合成，序列包括5’非编码区序列、成熟酶蛋白基因序列、衣壳蛋白基因序列、包装位点和复制酶基因序列，在序列5’端和3’端分别插入KpnI、BamHI酶切位点，双酶切后插入到原核表达载体pET32a中，获得表达载体pET32a-MS2-CP；c.pET32a-MS2-CP-ENV-2B质粒获得：将pET32a-MS2-CP和pUCm-ENV-2B均使用BamHI、NotI双酶切，回收pET32a-MS2-CP和ENV-2B序列片段并相互连接，然后转化至DH5α菌株，获得肠道病毒装甲RNA表达载体pET32a-MS2-CP-ENV-2B质粒；d.肠道病毒装甲RNA获得：将pET32a-MS2-CP-ENV-2B质粒转入大肠杆菌原核表达菌株BL21中，诱导表达，超声波破碎后离心、收集沉淀，获得肠道病毒装甲RNA的病毒样颗粒。与现有技术相比，本专利技术的优点在于肠道病毒PCR质控品装甲RNA及制备方法，该装甲RNA的表达载体为pET32a-MS2-CP-ENV-2B质粒，该表达载体pET32a-MS2-CP-ENV-2B质粒转入大肠杆菌原核表达菌株BL21中，诱导表达，超声波破碎后，离心收集沉淀，获得肠道病毒PCR质控品装甲RNA的病毒样颗粒，其中该表达载体pET32a-MS2-CP-ENV-2B质粒中，MS2-CP的核苷酸序列为序列表中SEQIDNO:1所示，ENV-2B的核苷酸序列为序列表中SEQIDNO:2所示；该装甲RNA储存时不会受到RNase酶降解，是性能稳定的肠道病毒PCR质控品；该装甲RNA的制备方法操作简单、安全和有效。具体实施方式以下结合实施例对本专利技术作进一步详细描述。实施例1：肠道病毒属病毒2B基因装甲RNA的获得和鉴定肠道病毒ENV-2B基因扩增：使用QiaGenRNeasyMiniKit提取试剂盒（购自Qiagen公司）提取临床CODEHOP阳性样本RNA，方法参照试剂盒说明书。采用肠病毒病毒属CODEHOP通用型引物E4559（市售）/FE4937（市售）扩增阳性样本，该对引物可用于肠道病毒属病毒检测。引物序列如序列表中SEQIDNO:3和4所示，反应体系为：2X1stepbuffer10µL、PrimerScript1setpEnzymeMix0.8µL、引物E4559/FE4937（20pmol）1µL、待检RNA1µL、补充Rnasefreewater至20µL。反应条件：42℃30min，94℃2sec，94℃30s，56℃30sec，72℃1min（35cycle），72℃10min。选用1.5%琼脂糖凝胶电泳观察PCR扩增效果。选用TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKit回收400bp左右的目的片段，方法参照试剂盒说明书。扩增片段插入至pUCm-T载体，得到pUCm-ENV-2B。取5μL连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，进行蓝白斑筛选。在转化的LB平板上挑取白色克隆，接种2mLLB液体培养基，37℃过夜培养，使用TaKaRaMiniBESTPlasmidPurificationKit小型质粒提取试剂盒提取质粒，方法参照说明书。使用BamHI、NotI双酶切pUCm-ENV-2B质粒，反应体系：10XKBuffer1µL、BamHI（15units/µL）1µL、NotI（10units/µL）1µL,0.1%BSA1µL,质粒1µL，DDW15µL，37℃酶切1h电泳观察PCR扩增效果，使用MiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKit胶回收试剂盒回收400bp左右ENV-2B片段，方法参照说明书。载体片段pET32a-MS2-CP获得：设计合成包含噬菌体MS2-CP蛋白序列片段并在序列两端分别插入KpnI1.BamHI酶切位点,并对MS2-CP蛋白部分核酸序列进行优化，合成MS2-CP蛋白的核苷酸序列如序列表中IDNO:1所示（委托生物公司合成并测序）。将合成MS2-CP蛋白的核苷酸序列和表达Pet-32a载体双酶切，酶切反应体系：10XKBuffer1µL、BamHI（15units/µL）1µL、KpnI（10units/µL）1µL,合成片段1µL，DDw16µL，37℃酶切1h。使用MiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKit胶回收试剂盒分别回收1800bp左右的MS2-CP蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.肠道病毒PCR质控品装甲RNA，其特征在于该装甲RNA的表达载体为 pET32a‑ MS2‑CP‑ENV‑2B质粒，该表达载体pET32a‑ MS2‑CP‑ENV‑2B质粒转入大肠杆菌原核表达菌株BL21中，诱导表达，超声波破碎后离心收集沉淀，获得肠道病毒PCR质控品装甲RNA的病毒样颗粒，其中该表达载体pET32a‑ MS2‑CP‑ENV‑2B质粒中，MS2‑CP的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:1所示，ENV‑2B的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:2所示。

【技术特征摘要】
1.肠道病毒PCR质控品装甲RNA，其特征在于该装甲RNA的表达载体为pET32a-MS2-CP-ENV-2B质粒，该表达载体pET32a-MS2-CP-ENV-2B质粒转入大肠杆菌原核表达菌株BL21中，诱导表达，超声波破碎后离心收集沉淀，获得肠道病毒PCR质控品装甲RNA的病毒样颗粒，其中该表达载体pET32a-MS2-CP-ENV-2B质粒中，MS2-CP的核苷酸序列为序列表中SEQIDNO:1所示，ENV-2B的核苷酸序列为序列表中SEQIDNO:2所示。2.权利要求1所述的肠道病毒PCR质控品装甲RNA的制备方法，其特征在于步骤如下：a.ENV-2B获得：以肠道病毒属CODEHOP引物E4559/FE4937扩增临床分离的阳性CODEHOP样本，并将扩增序列克隆至pUCm-T质粒载体中，获得目的序列片段pUCm-ENV-2B；b.噬菌体MS2-CP获得：以Genban...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡群，马思杰，
申请(专利权)人：中华人民共和国大榭出入境检验检疫局，
类型：发明
国别省市：浙江,33