本发明专利技术公开了一条主要参与合成丹参次生代谢产物姜烯等多种倍半萜合成的萜类合酶基因序列(SmTPS3)；本发明专利技术所提供的SmTPS3基因具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述基因编码的蛋白质具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。本发明专利技术基于丹参的基因组和转录组数据获得SmTPS3基因序列，通过构建pET28a‑SmTPS3原核表达载体，在大肠杆菌体内检测SmTPS3的催化产物，验证SmTPS3的基因功能。研究结果表明，SmTPS3具有催化合成多种倍半萜类化合物的功能。本发明专利技术提供的SmTPS3具有催化产生姜烯、α‑佛手柑油烯、β‑倍半水芹烯等多种倍半萜类化合物的功能。姜烯具有抗病毒、抗生育、抗溃疡等多种活性，还可作为食品调味剂和化妆品的原料；佛手柑精油在缓解焦虑、抑郁等情绪中具有良好疗效。本发明专利技术为基于丹参萜类合酶基因合成倍半萜类化合物的研究奠定基础，促进基于SmTPS3催化合成的产物——姜烯、α‑佛手柑油烯等倍半萜类化合物的药物研发和产业开发。
【技术实现步骤摘要】
一种应用丹参SmTPS3基因合成多种倍半萜类化合物的方法
本专利技术属于植物分子生物学和植物基因工程
，具体涉及丹参中一种参与合成姜烯等多种倍半萜化合物的萜类合酶基因的克隆、鉴定及功能验证方法。
技术介绍
丹参(SalviamiltiorrhizaBunge)为唇形科、鼠尾草属药用植物。鼠尾草属为唇形科植物中的一大分支，其属下植物多具有香气，挥发性物质较为丰富。目前已从134种鼠尾草属植物中分离出700多种化学成分，主要为萜类化合物、甾体类化合物和多酚类化合物，这些挥发性物质多具有抗寄生虫、抗菌、抗氧化、抗炎等功效。丹参作为鼠尾草属中的重要药用植物，其体内含有大量挥发性物质。这些挥发性物质的生物合成途径目前仍未被解析。植物基因组中存在一个特殊的基因家族——萜类合酶(Terpenesynthase，TPS)基因家族，它们编码参与萜类(单萜、倍半萜、二萜)合成的核心酶基因。2015年，丹参基因组信息被成功解析，共有约3万个基因被注释。其中，丹参TPS基因家族中包含73个基因，分为TPS-a、b、c、e/f、g五个亚家族，其中，TPS-a亚家族(27个基因)和TPS-b亚家族(20个基因)是丹参TPS基因家族中较大的亚家族。已有研究表明，多数物种的TPS-b亚家族中的TPS多编码单萜合酶或异戊二烯合酶，少数成员编码倍半萜合酶。这些TPS特异性存在于开花植物中。SmTPS3是丹参萜类合酶TPS-b亚家族中的成员。研究发现，SmTPS3在大肠杆菌中主要催化姜烯、α-佛手柑油烯、β-倍半水芹烯多种倍半萜类化合物的生物合成。本专利技术为利用生物工程技术生产姜烯等具有生物活性的倍半萜类化合物提供有效方法，同时也为应用丹参SmTPS3合成姜烯、α-佛手柑油烯等化合物并将这些化合物用于医药产品开发奠定基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于研究丹参倍半萜合酶基因的生物学功能，提供一种参与姜烯等倍半萜合成的TPS合酶基因及其编码的蛋白质、其扩增引物、以及表达载体pET28a-SmTPS3、其催化产物及应用。本专利技术的另一目的在于提供对倍半萜合酶基因SmTPS3的功能验证方法。本专利技术提供的SmTPS3基因，其核苷酸序列为SEQIDNo.1所示。本专利技术提供的SmTPS3基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。本专利技术设计出了扩增SmTPS3基因的克隆引物，其碱基序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。构建了表达载体pET28a-SmTPS3，其碱基序列含SmTPS3基因的cDNA碱基序列。本专利技术目的可通过如下技术方案实现：构建pET28a-SmTPS3，转化至大肠杆菌表达菌株进行蛋白异源表达，以0.5mMIPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导蛋白表达。通过固相微萃取技术和气质联用(GC-MS)技术检测基因在原核表达系统中的产物，获得SmTPS3主要产物为姜烯、α-佛手柑油烯、β-倍半水芹烯等。附图说明图1所示为丹参TPS-b亚家族成员构建的系统进化树图2所示为SmTPS3在丹参不同器官中的差异表达谱图3所示为SmTPS3原核表达体系中GC-MS检测的产物结果图4所示为SmTPS3原核表达体系中各产物的质谱图结果具体实施方式以下结合实例详细说明本专利技术。实施是为更好的理解本专利技术，但不限定于本专利技术。以下实施方法中的实验方法均为常规方法，所涉及的实验试剂均为常规生化试剂。实施例1SmTPS3基因克隆及结构分析1)采用RT-qPCR技术对丹参不同组织器官中SmTPS3基因进行差异表达预测。结果以柱状图的形式呈现，如图2所示。可以发现SmTPS3在丹参茎中显著高表达。2)依据SmTPS3序列设计引物，以丹参cDNA为模板进行扩增，获得长度为1614bp的核苷酸序列，如SEQIDNo.1。根据全长cDNA序列翻译后获得丹参SmTPS3的氨基酸序列，如SEQIDNo.2。实施例2SmTPS3基因的原核表达体系构建及代谢产物检测1)选取BamHI/XhoI作为酶切位点，对SmTPS3和pET28a载体进行酶切及连接反应，构建该基因的异源表达载体pET28a-SmTPS3。2)分别将pET28a空载体和pET28a-SmTPS3转化至感受态细胞BL21(DE3)中，涂布于含有50mg/LKana(卡纳霉素)的LB固体培养基平板中筛选阳性克隆。挑选阳性克隆的单菌落接种于含相应抗生素(50mg/LKana)的LB液体培养基中，培养过夜。次日，按1∶50的比例进行转接及扩大培养，待菌液的OD600达到0.4-0.6之间时，加入0.5mM的IPTG，于25℃摇床中，避光诱导蛋白表达20h，转速设为110r/min。3)取10mL诱导后菌液置于20mL顶空瓶中，萃取温度为60℃、震荡频率为500rpm、萃取时间约为30min，以固相微萃取柱(萃取纤维PDMS，100μm)作为萃取头进行萃取。4)GC-MS仪器为岛津QP2010ultra(HP-5ms：30m×0.25mm×0.25μm)，直接由固相微萃取柱进样。热脱附温度280℃，脱附时间：3min。色谱条件：40℃保持2min，以10℃/min涨至300℃保持5min，氦气流速1ml/min。质谱条件：离子源温度200℃，接口温度250℃，scan模式采集45-500。获得如下结果：相对于转化空载体的对照菌株，含pET28a-SmTPS3的菌株在7.243min出现产物桧烯，13.613min出现产物姜烯，13.976/14.251min出现产物α-佛手柑油烯，14.331min出现产物β-倍半水芹烯，14.428min出现产物(E)-β-合金欢烯，14.909min出现产物cis-β-合金欢烯，15.195min出现产物α-雪松烯，15.621min出现产物7-epi-cis-倍半香桧烯水合物，其中以姜烯、α-佛手柑油烯、β-倍半水芹烯等为主要产物，如图3所示。各产物质谱图如图4所示。本专利技术基于丹参全基因组信息，获得了TPS基因家族中的SmTPS3序列，通过基因克隆、功能分析及产物验证，发现SmTPS3在原核体系中主要催化姜烯、α-佛手柑油烯、β-倍半水芹烯等倍半萜类化合物的生物合成。本专利技术鉴定了一个丹参倍半萜合酶的功能，为解析丹参SmTPS3催化合成姜烯、α-佛手柑油烯等倍半萜类化合物的合成途径奠定基础，也为实现异源合成姜烯等活性化合物从而用于医药产品研发提供高效而便捷的方法。以上所述仅是本专利技术的优选实施方式，应当指出，对于本
的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本专利技术的保护范围。本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种丹参萜类合酶(SmTPS3)编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种丹参萜类合酶(SmTPS3)编码基因，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。2.根据权利要求1所诉的丹参中催化姜烯等多种倍半萜化合物合成的相关基因SmTPS3，其特征在于，所诉基因SmTPS3编码蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。3.一种原核表达体系检测基因产物的方法，其特征在于，将pET28a-SmTPS3蛋白异源表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，经卡纳霉素筛选获得阳性克隆，对阳性克隆扩大培养后，加入0.5mM的IPTG，于25℃摇床中，110r/min，避光诱导蛋白表达20h。诱导完成后，取10mL菌液在萃取温度60℃，震荡频率500rpm，萃取时间约30min条件下，以固相微萃取柱...
【专利技术属性】
技术研发人员：罗红梅，刘琬菁，
申请(专利权)人：中国医学科学院药用植物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11
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