一种嗜热脂肪土芽孢脂肪酶基因分泌表达方法技术

本发明专利技术公开了一种嗜热脂肪土芽孢脂肪酶基因分泌表达方法，Genbank中搜索获得嗜热脂肪土芽孢脂肪酶成熟肽基因，按照毕赤酵母对遗传密码子的喜好性对嗜热脂肪土芽孢脂肪酶成熟肽基因进行密码子优化；按照定点突变PCR的要求，分别设计三对引物；对三轮Kex2定点突变后的嗜热脂肪土芽孢脂肪酶成熟肽基因进行测序；将合成的野生型或Kex2定点突变的嗜热脂肪土芽孢脂肪酶成熟肽基因与毕赤酵母表达质粒分别进行酶切；提取上述菌株中经测序鉴定的质粒，本发明专利技术通过定点突变，改变了嗜热脂肪土芽孢脂肪酶成熟肽序列中三个潜在的丝氨酸蛋白酶识别位点Kex2，在毕赤酵母表达系统中获得了全长完整表达的、有更高酶活性的嗜热脂肪土芽孢脂肪酶。

【技术实现步骤摘要】
一种嗜热脂肪土芽孢脂肪酶基因分泌表达方法
本专利技术涉及到生物化学与分子生物学
，特别涉及一种嗜热脂肪土芽孢脂肪酶基因分泌表达方法。
技术介绍
脂肪酶(lipase，E.C.3.1.1.)，又叫甘油脂水解酶(triacylglycerolacylhydrolase)，是一种可以分解脂肪、具有脂质降解能力的蛋白酶。脂肪酶可以将三酰甘油酯水解为脂肪酸、二酰甘油酯、单酸甘油酯和甘油。脂肪酶的天然底物一般是不溶于水的长链脂肪酸酰基酯，其反应特点是在油水界面起催化作用(1)。根据底物的性质，可划分为脂肪酶，酯酶，磷脂酶，或角质酶。脂肪酶是最重要的工业用酶之一，被广泛应用于食品、饲料、洗涤、制革、医药、油酯化工等领域。由于生物酶法合成生物柴油，即利用脂肪酶在非水相中的转酯化反应将动植物油脂和低碳醇催化制备成相应的脂肪酸甲酯或脂肪酸乙酯，具有条件温和及无排放污染等优点，脂肪酶在绿色能源领域近年来也得到越来越多的应用。来源于嗜热脂肪土芽孢杆菌T1菌株(GeobacillusstearothermophilusstrainT1)的脂肪酶(GENBANK登录号JC8061),是一种耐热性碱性脂肪酶(E.C.3.1.1.3)。其对不同碳链的天然或合成的底物都表现出活性，尤其偏爱C4-C16的底物，最适底物是C8的底物。嗜热脂肪土芽孢脂肪酶在各种洗涤剂成分存在下，例如表面活性剂或其它洗涤剂成分存在下，仍具有羧酸酯水解酶活性，可以水解脂质。这一特性使得该脂肪酶非常适合应用于洗涤剂工业。另外，该脂肪酶还具有转酯化的能力，可将脂肪酸和乙醇催化反应成脂肪酸乙酯。巴斯德毕赤酵母(PichiaPastoris)是近年来越来越受到重视的一个高效的真核表达系统。该表达系统具有许多独特的优点，并己迅速发展成为分子生物学领域中被广泛用于重组蛋白生产的主要手段之一。毕赤酵母作为真核表达系统具有以下优势:(1)毕赤酵母生长迅速，在简单合成培养基中可实现高密度培养；(2)毕赤酵母具有精确调控的启动子，包括甲醇依赖型启动子或非甲醇依赖型组成型启动子，都可以高效表达目的外援蛋白；(3)外源蛋白表达效率高，而自身分泌蛋白少，其表达的外源蛋白可占总分泌表达蛋白的90％以上，有利于外源目的蛋白的分离纯化；(4)毕赤酵母具有真核生物特有的蛋白翻译后修饰、折叠及高效分泌，可以克服原核表达系统的可溶性蛋白表达量低、及单位质量蛋白的酶活性低等缺陷。因此，毕赤酵母成为近年来作为表达外源目的蛋白最有前途的表达系统。但是，嗜热脂肪土芽孢脂肪酶只有在细菌中成功表达的报道(2)。我们发现，嗜热脂肪土芽孢脂肪酶在巴斯德毕赤酵母表达系统中表达时，遇到的主要问题就是表达产物出现了不同程度的降解。分泌表达的完整嗜热脂肪土芽孢脂肪酶的大小应为46kDa,但我们也发现了其它小分子质量的产物。这些小分子量产物具有与嗜热脂肪土芽孢脂肪酶相同的N-端氨基酸序列,而且这些片段的C末端含有成对的碱性氨基酸残基。进一步的研究发现,该脂肪酶的特征性降解是由酵母细胞中存在的钙离子依赖性丝氨酸内切蛋白酶(kexin,EC3.4.21.61)引起的。丝氨酸内切蛋白酶是酵母细胞自身编码的一种前体加工酶,位于酵母细胞膜上,该酶的作用位点是双碱性氨基酸残基,它主要负责大多数酵母蛋白的分泌与成熟,如信号肽或前导肽的加工处理等(3-5)。我们在嗜热脂肪土芽孢脂肪酶的成熟肽序列中发现了3个潜在的丝氨酸内切蛋白酶的特异性识别位点Kex2(6)。
技术实现思路
专利技术的目的在于提供一种嗜热脂肪土芽孢脂肪酶基因分泌表达方法，通过定点突变的方法，改变了嗜热脂肪土芽孢脂肪酶成熟肽序列中3个潜在的丝氨酸蛋白酶识别位点Kex2，在毕赤酵母中获得了完整表达的、酶活性更高的嗜热脂肪土芽孢脂肪酶，克服了该脂肪酶在细菌表达系统中表达量较低、单位质量的脂肪酶活性较低等缺陷，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种嗜热脂肪土芽孢脂肪酶基因分泌表达方法，包括如下步骤：步骤一：Genbank中搜索获得嗜热脂肪土芽孢脂肪酶成熟肽基因，按照毕赤酵母对遗传密码子的喜好性对嗜热脂肪土芽孢脂肪酶成熟肽基因进行密码子优化；步骤二：按照定点突变PCR的要求，分别设计三对引物；分别为:A1:GTTGCCAGAATTGAAGCAAGGTGGTAGAATCCA；A2:TGGATTCTACCACCTTGCTTCAATTCTGGCAAC；B1:TCGAAAGATTGAAGCAATCCCCAGTTTGGAC；B2:GTCCAAACTGGGGATTGCTTCAATCTTTCGA；C1:TGAACGGTCCAAAGCAAGGTTCTTCTGATAG；C2:CTATCAGAAGAACCTTGCTTTGGACCGTTCA；交由IDT进行引物合成；步骤三：以A1和A2为引物，进行PCR反应定点突变R103Q，以B1和B2为引物，进行PCR反应定点突变R230Q，再以C1和C2为引物，进行PCR反应定点突变R330Q；步骤四：对三轮Kex2定点突变后的嗜热脂肪土芽孢脂肪酶成熟肽基因进行测序，测序结果显示通过定点突变PCR后的嗜热脂肪土芽孢脂肪酶基因序列与预先设计的序列一致；步骤五：将合成的野生型或Kex2定点突变的嗜热脂肪土芽孢脂肪酶成熟肽基因与毕赤酵母表达质粒分别进行酶切，胶回收酶切片段，T4连接酶连接两者后转化大肠杆菌，获得含有启动子-α因子信号肽-嗜热脂肪土芽孢脂肪酶成熟肽基因的表达质粒的菌株，挑克隆提取质粒后测序；步骤六：提取上述菌株中经测序鉴定的质粒，酶切线性化后电转化pep4/prb1双蛋白酶缺陷型巴斯德毕赤酵母感受态细胞，转化后的细胞涂布于带有不同浓度的zeocin抗性的YPD平板，挑克隆，对克隆进行小量发酵培养，检测酶活力，以获得新型高效的嗜热脂肪土芽孢脂肪酶基因的毕赤酵母工程菌。优选的，成熟肽序列中3个潜在的丝氨酸蛋白酶识别位点Kex2被改变为其它氨基酸残基并按毕赤酵母偏爱密码子设计的嗜热脂肪土芽孢脂肪酶基因。优选的，表达载体为含有高效甲醇诱导启动子AOX1或非甲醇依赖性的组成型启动子GAP的质粒。优选的，步骤一中由GenScript对优化过的基因进行合成，合成的基因序列由Macrogen进行测序，测序结果与预先设计的基因序列一致。优选的，步骤三中氨基酸编号以嗜热脂肪土芽孢脂肪酶成熟肽的第一个氨基酸为1。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术采用毕赤酵母表达系统以及按照毕赤酵母喜好性优化密码子后的嗜热脂肪土芽孢脂肪酶基因，更有利于该脂肪酶的翻译后修饰、折叠及高效分泌。通过定点突变嗜热脂肪土芽孢脂肪酶成熟肽序列中的三个丝氨酸蛋白酶识别位点Kex2，避免了分泌的脂肪酶被酵母细胞内源性丝氨酸内切蛋白酶kexin降解，在毕赤酵母中获得了完整表达的、高酶活的嗜热脂肪土芽孢脂肪酶。这在嗜热脂肪土芽孢脂肪酶的研究领域尚属首次，为嗜热脂肪土芽孢脂肪酶的大规模工业化生产提供了可靠保障。附图说明图1为本专利技术的不同P-NP底物存在下脂肪酶的活性柱状图；图2为本专利技术的pH对脂肪酶活性的影响折线图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种嗜热脂肪土芽孢脂肪酶基因分泌表达方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤一：Genbank中搜索获得嗜热脂肪土芽孢脂肪酶成熟肽基因，按照毕赤酵母对遗传密码子的喜好性对嗜热脂肪土芽孢脂肪酶成熟肽基因进行密码子优化；步骤二：按照定点突变PCR的要求，分别设计三对引物；分别为:A1:GTTGCCAGAATTGAAGCAAGGTGGTAGAATCCA；A2:TGGATTCTACCACCTTGCTTCAATTCTGGCAAC；B1:TCGAAAGATTGAAGCAATCCCCAGTTTGGAC；B2:GTCCAAACTGGGGATTGCTTCAATCTTTCGA；C1:TGAACGGTCCAAAGCAAGGTTCTTCTGATAG；C2:CTATCAGAAGAACCTTGCTTTGGACCGTTCA；交由IDT进行引物合成；步骤三：以A1和A2为引物，进行PCR反应定点突变R103Q，以B1和B2为引物，进行PCR反应定点突变R230Q，再以C1和C2为引物，进行PCR反应定点突变R330Q；步骤四：对三轮Kex2定点突变后的嗜热脂肪土芽孢脂肪酶成熟肽基因进行测序，测序结果显示通过定点突变PCR后的嗜热脂肪土芽孢脂肪酶基因序列与预先设计的序列一致；步骤五：将合成的野生型或Kex2定点突变的嗜热脂肪土芽孢脂肪酶成熟肽基因与毕赤酵母表达质粒分别进行酶切，胶回收酶切片段，T4连接酶连接两者后转化大肠杆菌，获得含有启动子‑α因子信号肽‑嗜热脂肪土芽孢脂肪酶成熟肽基因的表达质粒的菌株，挑克隆提取质粒后测序；步骤六：提取上述菌株中经测序鉴定的质粒，酶切线性化后电转化pep4/prb1双蛋白酶缺陷型巴斯德毕赤酵母感受态细胞，转化后的细胞涂布于带有不同浓度的zeocin抗性的YPD平板，挑克隆，对克隆进行小量发酵培养，检测酶活力，以获得新型高效的嗜热脂肪土芽孢脂肪酶基因的毕赤酵母工程菌。...

【技术特征摘要】
1.一种嗜热脂肪土芽孢脂肪酶基因分泌表达方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤一：Genbank中搜索获得嗜热脂肪土芽孢脂肪酶成熟肽基因，按照毕赤酵母对遗传密码子的喜好性对嗜热脂肪土芽孢脂肪酶成熟肽基因进行密码子优化；步骤二：按照定点突变PCR的要求，分别设计三对引物；分别为:A1:GTTGCCAGAATTGAAGCAAGGTGGTAGAATCCA；A2:TGGATTCTACCACCTTGCTTCAATTCTGGCAAC；B1:TCGAAAGATTGAAGCAATCCCCAGTTTGGAC；B2:GTCCAAACTGGGGATTGCTTCAATCTTTCGA；C1:TGAACGGTCCAAAGCAAGGTTCTTCTGATAG；C2:CTATCAGAAGAACCTTGCTTTGGACCGTTCA；交由IDT进行引物合成；步骤三：以A1和A2为引物，进行PCR反应定点突变R103Q，以B1和B2为引物，进行PCR反应定点突变R230Q，再以C1和C2为引物，进行PCR反应定点突变R330Q；步骤四：对三轮Kex2定点突变后的嗜热脂肪土芽孢脂肪酶成熟肽基因进行测序，测序结果显示通过定点突变PCR后的嗜热脂肪土芽孢脂肪酶基因序列与预先设计的序列一致；步骤五：将合成的野生型或Kex2定点突变的嗜热脂肪土芽孢脂肪酶成熟肽基因与毕赤酵母表达质粒分别...

【专利技术属性】
技术研发人员：王瑞工，刘伊佳，李逸明，
申请(专利权)人：深圳昇瑞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44