本发明专利技术公开了一株表达多聚磷酸激酶的重组菌，包括宿主细胞和转入宿主细胞的重组载体，所述重组载体由原始载体及接入原始载体的目的基因构成。本发明专利技术提供的用于编码多聚磷酸激酶的碱基序列如SEQ ID No:1所示。本发明专利技术的大肠杆菌基因工程菌可以高效表达多聚磷酸激酶，其诱导酶活可达3.92U/mg，该酶表现出良好的催化活性和稳定性，对底物AMP的转化率达到95％以上。本发明专利技术还公开了上述基因工程菌在ATP再生过程中的应用，与现有的ATP再生的方法相比，本发明专利技术中应用的多聚磷酸激酶可作为单一的酶将AMP再生为ATP，简化了酶的使用，降低了ATP再生的成本。
【技术实现步骤摘要】
一株表达多聚磷酸激酶的重组菌及其应用
本专利技术涉及一株基因工程菌，具体涉及一株表达多聚磷酸激酶的重组菌及其应用。
技术介绍
三磷酸腺苷(ATP)是生物体内最重要的高能磷酸化合物，在临床可用做治疗脑血管疾病、进行性肌萎缩、脑损伤、心机能不全、肾炎、心肌炎及肝炎等疾病的辅酶类药物。在生物催化的过程中，ATP作为生物合成中的能量货币，许多物质的生物合成都需要ATP作为能量的供体，以推动反应的顺利进行。但ATP的价格相对昂贵，若能建立一个适宜的反应系统，在这个系统中，由ATP降解而来的ADP(或AMP)可通过其它途径再合成ATP，使ATP能够循环使用，这样就有可能采用能够再生ATP的廉价底物来替代ATP，从而提高有用物质生产过程的经济性。目前常用的ATP再生方法有全细胞催化法(如酿酒酵母、产氨棒杆菌和枯草芽孢杆菌等)以及酶催化法(如乙酸激酶、丙酮酸激酶以及多聚磷酸激酶等)，其中能量供体涉及葡萄糖、乙酰磷酸及多聚磷酸等。由于以多聚磷酸盐作为底物具有廉价、稳定、无毒、不产或少量产生副产物等特点，利用多聚磷酸再生ATP体系极具吸引力，因此通过多聚磷酸酶(PPK)进行ATP再生的极具应用前景。不同来源的PPK，催化特点各不相同。如，来源于大肠杆菌的PPK1(EcPPK)已应用于葡萄糖-6-磷酸的生产及低聚糖合成等；来源于Acinetobacterjohnsonii的PPK2(AjPPK2)和来源于Sinorhizobiummelilot的PPK2(SmPPK2)分别被用于AMP和ADP的磷酸化；来源于嗜热生物Thermosynechococcuselongates和Thermusthermophilus的重组PPK1被应用于耐高温的ATP依赖型反应中。相关ATP再生系统的研究报道大部分集中于从ADP起始的ATP再生方法，从AMP起始的ATP再生系统相关研究非常少。所以，亟待找到一种合适的多聚磷酸激酶，能够以单一酶催化AMP和低聚合度的聚磷酸盐生成ATP，使ATP再生过程经济、方便，实现ATP再生体系更广泛的应用。
技术实现思路
专利技术目的：为了解决ATP价格昂贵的问题，本专利技术第一方面提供编码多聚磷酸激酶的PPK基因，本专利技术第二方面提供含有所述PPK基因的重组载体，本专利技术第三方面提供含有所述重组载体的重组菌，本专利技术第四方面提供所述重组菌在表达多聚磷酸激酶中的应用，本专利技术第五方面提供所述重组菌在ATP再生中的应用。技术方案：本专利技术第一方面提供一种编码多聚磷酸激酶的PPK基因，其核苷酸序列如SEQIDNo:1所示，其氨基酸序列为SEQIDNo:2所示。该PPK基因长度为855bp，编码284个氨基酸和一个终止密码子，编码的多聚磷酸激酶以AMP为底物合成ATP。所述PPK基因来自于节杆菌(Arthrobactersp.CGMCCNo.3584)中，该菌株已公开于中国专利技术专利申请201010191515.6中。本专利技术第二方面提供含有SEQIDNo:1所示PPK基因的重组载体。优选地，所述重组载体为融合型表达载体，优选出发载体为pET28a，所述PPK基因插入pET28a的SalⅠ和NdeⅠ酶切位点之间。本专利技术第三方面提供含所述重组载体的重组菌；优选地，所述宿主菌为EscherichiacoliRosetta(DE3)。其中，重组菌的构建方法如下：(1)利用一步克隆法将PPK基因片段插入出发载体pET28a的SalⅠ和NdeⅠ酶切位点之间得到重组载体pET28a-PPK；(2)将重组载体pET28a-PPK通过热击法转化至EscherichiacoliRosetta(DE3)中，即得重组菌。本专利技术第四方面提供重组菌在表达多聚磷酸激酶中的应用。所述重组菌经IPTG诱导表达，可在胞内获得多聚磷酸激酶；诱导表达后，通过超声破碎将重组菌中的多聚磷酸激酶释放出来，获得粗酶液。本专利技术第五方面提供重组菌在制备ATP中的应用；包括以下步骤：(1)将活化的重组菌接种到LB培养基中，培养至OD600nm为0.6-0.8时，加入IPTG，IPTG的终浓度为0.1-1mM，诱导表达10-20h；离心收集菌泥，将菌泥进行超声破碎，离心得到含多聚磷酸激酶的粗酶液；(2)在Tris-HCl缓冲体系中添加金属离子、磷酸供体和AMP，添加步骤(1)得到的粗酶液催化AMP生成ATP。步骤(1)中，优选地，IPTG的终浓度为0.2mM，诱导表达20h。步骤(2)中，所述金属离子为Mg2+，所述磷酸供体为多聚磷酸盐；所述含金属离子的化合物优选为MgCl2，所述磷酸供体优选为四聚磷酸盐或六偏磷酸盐；所述Tris-HCl缓冲体系的浓度为50-100mM，所述金属离子的浓度为5-20mM，所述磷酸供体的浓度为0.5-2mM，所述AMP的浓度为0.5-2mM，所述酶用量为0.02-1U/mL反应液，所述催化条件为pH5.0-10.0，10-50℃反应4-12h。优选地，所述Tris-HCl缓冲体系的浓度为100mM，所述金属离子的浓度为20mM，所述磷酸供体的浓度为2mM，所述AMP的浓度为2mM，所述酶用量为0.23U/mL反应液，所述催化条件为pH8.0，30℃反应4h。本专利技术第六方面提供重组菌在ATP再生中的应用。有益效果：本专利技术首次扩增了节杆菌(Arthrobactersp.CGMCC3584)中多聚磷酸激酶的基因PPK，并实现了PPK基因在E.coliRosetta(DE3)中的高效表达；IPTG诱导表达重组大肠杆菌，纯酶液的酶活为3.92U/mg。将该重组大肠杆菌应用于ATP再生过程，多聚磷酸激酶能够作为单一酶，利用价格低廉的四聚磷酸盐或者六偏磷酸盐为磷酸供体，以AMP为底物生成ATP，对底物AMP的转化率达到95％以上，ATP生成率为48.6％，简化了酶的使用，降低了ATP再生的成本，ATP可再生2-50个循环。附图说明图1为PPK全长基因PCR的电泳图，其中泳道1为PCR产物，泳道2为10,000bpMarker；图2为pET28a-PPK质粒图谱；图3为重组菌提取质粒酶切验证的电泳结果，其中泳道1为10,000bpMarker，泳道2为重组质粒SalⅠ和NdeⅠ双酶切结果；图4为诱导表达多聚磷酸激酶纯化后蛋白电泳结果，其中泳道1为蛋白Marker，泳道2为纯化的多聚磷酸激酶；图5为类短短芽孢杆菌来源的的短杆菌酪肽合成酶(TycA-A)与多聚磷酸激酶粗酶液催化酰胺键形成的反应体系。具体实施方式实施例1节杆菌中PPK基因的克隆及重组载体的构建PPK基因来自节杆菌(Arthrobactersp.CGMCCNo.3584)，该菌株已公开于中国专利技术专利申请201010191515.6中。以上述的节杆菌基因组为模板，PCR扩增PPK基因。引物序列如下：上游引物：5’-GTGCCGCGCGGCAGCCATATGATGTCCGCCGCCACAGGCTTTG-3’(含SalⅠ酶切位点，见横线部分)下游引物：5’-TGCGGCCGCAAGCTTGTCGACTCAGGACCGCACTACCAGCTC-3’(含NdeⅠ酶切位点，见横线部分)PCR反应体系及反应条件见表1。表1PPK基因的PCR反应体系及反应条件其中，DNA模板使用质粒DNA小量提取试剂盒(购自AxyPrep公本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种编码多聚磷酸激酶的PPK基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。
【技术特征摘要】
1.一种编码多聚磷酸激酶的PPK基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNo:1所示。2.含有权利要求1所述PPK基因的重组载体。3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，所述出发载体为pET28a。4.含有权利要求2或3任意一项所述重组载体的重组菌。5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，所述宿主菌为EscherichiacoliRosetta(DE3)。6.权利要求4所述的重组菌在表达多聚磷酸激酶中的应用。7.权利要求4所述的重组菌在制备ATP中的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：(1)将活化的重组菌接种到LB培...
【专利技术属性】
技术研发人员：应汉杰，丁梦林，牛欢青，王骏之，柳东，庄伟，朱晨杰，陈勇，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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