GmMDH12基因在促进大豆结瘤固氮能力方面的应用制造技术

本发明专利技术公开了GmMDH12基因在促进大豆结瘤固氮能力方面的应用。具体是苹果酸脱氢酶基因GmMDH12控制根瘤苹果酸合成及其在促进豆科作物根系结瘤方面的应用。本发明专利技术研究发现，GmMDH12具有调控大豆根瘤苹果酸合成的功能，超量表达GmMDH12显著增加了大豆转基因复合植株根瘤内源苹果酸浓度，增加了根瘤数和根瘤生物量，从而提高了植株氮含量和生物量。依据本发明专利技术，GmMDH12基因具有通过转基因技术提高豆科作物生物固氮功能的潜力，对提高作物养分高效利用以及环境友好型可持续农业的发展具有重要的理论和实践意义。

【技术实现步骤摘要】
GmMDH12基因在促进大豆结瘤固氮能力方面的应用
本专利技术属于植物基因工程
更具体地，涉及GmMDH12基因在促进大豆结瘤固氮能力方面的应用。
技术介绍
豆科植物根系能够和根瘤菌形成互利互补的共生系统--根瘤。宿主植物能够为根瘤菌的生长提供碳源和合适的生长环境，而根瘤菌则通过固氮酶的作用进行生物固氮，为宿主生长提供氮源。将根瘤菌接种技术应用于农业生产，改善作物氮营养，是豆科作物节肥增产的有效措施，在农业生产中发挥着重要的作用(Qinetal.,2012)。豆科植物根瘤菌的生长、根瘤的形成以及生物固氮是一个复杂的生理生化过程，由许多代谢途径共同参与完成，其中包括碳代谢途径(Hernándezetal.,2009)。大豆[Glycinemax(L.)Merr]是全世界范围内一种重要的油料和蛋白质作物，是食用油和食用蛋白的重要原料，也是我国最重要的豆科作物。大豆能够和根瘤菌互利共生形成根瘤，可以改善大豆的氮营养，降低氮肥投入。在根瘤碳代谢过程中，磷酸烯醇丙酮酸(Phosphoenolpyruvate,PEP)是一个重要的中间代谢产物。在根瘤中，PEP主要通过两个途径被同化，一个是合成有机酸进入根瘤的三羧酸循环途径，另一个则是进入氮同化的氨基酸代谢途径(Whiteetal.,2007)。研究认为，在根瘤菌中，碳代谢的主要方向是经PEP生成草酰乙酸(Oxaloacetate,OAA)，最后合成苹果酸的途径(LeRouxetal.,2008)。通过14C标记试验，发现在根瘤中的苹果酸具有标记信号，暗示苹果酸可能作为碳代谢的产物在根瘤中积累，苹果酸被认为是根瘤菌呼吸代谢过程中的重要碳源，进一步被用于根瘤菌的代谢消耗(Rosendahletal.,1990;LeRouxetal.,2006)。苹果酸脱氢酶基因MDH(EC.1.1.1.37)能催化苹果酸与OAA的可逆转化，是三羧酸循环途径中的关键酶。在苜蓿、豌豆和菜豆等豆科作物中，发现接种根瘤菌可以显著提高MDH酶活性，而根瘤中MDH酶活性的增加被认为主要作用于调控根瘤碳代谢途径中苹果酸的合成(Milleretal.,1998;Colebatchetal.,2002;LeRouxetal.,2008;Hernándezetal.,2009)。并且，大量研究也表明，超量表达MDH基因，能够增加苜蓿，大豆和烟草等植株内源苹果酸的含量(Tesfayeetal.,2001;Lüetal.,2012)。但是，调控根瘤苹果酸合成的重要基因，以及增加苹果酸的合成是否能够促进根系结瘤、提高豆科作物的氮营养仍不清楚。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，通过蛋白质组学和定量PCR等分析方法，在大豆根瘤中同源克隆了一个GmMDH12基因（序列如SEQIDNO.3所示，编码氨基酸序列如SEQIDNO.4所示），发现其在蛋白及转录水平上同时受到低磷增强表达，证明了GmMDH12基因编码的蛋白具有促进根瘤苹果酸合成的生物学功能，进而促进了根系结瘤，并最终提高了转基因材料根瘤固氮能力及生物量。本专利技术的目的是提供GmMDH12基因在促进大豆结瘤固氮能力方面的应用。本专利技术另一目的是提供GmMDH12基因增强根瘤苹果酸合成方面的应用。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：本专利技术涉及一个基因的功能和应用。具体的，本专利技术提供一种利用苹果酸脱氢酶基因GmMDH12增加豆科根瘤苹果酸合成，促进结瘤固氮、提高植物氮效率的方法，通过超量表达GmMDH12，转基因大豆复合植株具有增加根瘤内源苹果酸浓度，增加根瘤数量和生物量，以及提高植株氮含量的表型。本专利技术首先进行了苹果酸脱氢酶GmMDH12基因全长cDNA的克隆，并进行了如下研究（1）采用大肠杆菌蛋白表达和纯化系统，分析GmMDH12酶学性质；采用构建大豆转基因复合植株方法，在大豆毛根中分析了GmMDH12基因的组织定位，在大豆毛根中超量表达GmMDH12，比较研究了GmMDH12转基因株系与对照株系在根系结瘤等方面的表型。（2）获得了GmMDH12启动子驱动GUS报告基因的大豆转基因复合植株，分析了GmMDH12基因的组织化学定位。（3）获得了GmMDH12-GST融合蛋白。（4）获得了超量表达GmMDH12的大豆转基因复合植株。本专利技术研究结果显示：（1）本专利技术所述基因的组织化学定位分析表明，GmMDH12主要定位于类菌体侵染细胞、维管束和皮层等根瘤组织中。（2）本专利技术所述GmMDH12基因编码的蛋白具有体外催化草酰乙酸合成苹果酸的活性。（3）本专利技术所述基因的超量表达转基因复合植株根瘤苹果酸浓度显著高于对照株系，即超量表达GmMDH12增加转基因复合植株根瘤内源苹果酸浓度。（4）在低氮处理和接种根瘤菌条件下，本专利技术所述基因的超量表达转基因复合植株的根瘤数量和生物量均显著高于对照株系，且植株氮含量和干重显著高于对照株系。即超量表达GmMDH12增加转基因复合植株根瘤数和根瘤生物量，增加转基因复合植株干重和氮含量。（5）本专利技术通过对GmMDH12在大豆转基因复合植株的功能分析，明确了GmMDH12在豆科根瘤生长过程中的功能，阐明GmMDH12参与的根系结瘤机制，为包括大豆在内的豆科作物氮高效利用提供了基因资源和理论基础，具有节肥高产的应用前景，对发展环境友好型可持续农业具有重要的实践意义。因此，以下应用均应在本专利技术的保护范围之内：GmMDH12基因在增强豆科植物根瘤苹果酸合成方面的应用。GmMDH12基因在促进豆科植物结瘤固氮能力方面的应用。GmMDH12基因在培育根系结瘤能力和/或生物固氮能力强的豆科植物方面的应用。优选地，所述豆科植物为大豆。另外，基于本专利技术，还提供了一种构建根系结瘤能力和/或生物固氮能力强的转基因大豆的方法，是将GmMDH12基因在大豆中过表达。具体地，构建超量表达GmMDH12转基因复合大豆的方法如下：S1.构建超量表达载体以大豆根瘤cDNA为模板，用SEQIDNO:14和SEQIDNO:15所示上下游特异引物PCR扩增GmMDH12基因序列；PCR扩增片段回收测序无误后，通过SacI和XbaI对扩增片段及目的载体PTF101S分别进行双酶切后，将GmMDH12基因扩增片段连接到目的载体PTF101S上，得到表达载体；S2.转化随后通过冻融法将构建好的表达载体转入到K599中，利用农杆菌介导大豆转基因复合植株进行转化，得到转基因复合植株；S3.验证提取转基因复合植株根系和根瘤RNA，反转录成cDNA，通过定量PCR检测GmMDH12基因表达效果。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术研究发现，苹果酸脱氢酶基因GmMDH12在大豆根瘤生长代谢方面的功能：GmMDH12在成熟根瘤类菌体的侵染细胞、维管束和皮层等根瘤组织中均有表达，且随着根瘤生长时间的延长，该基因表达量逐渐增加。在大豆根瘤苹果酸合成方面的功能：GmMDH12在体外具有催化草酰乙酸合成苹果酸的功能。并且，与对照相比，超量表达GmMDH12显著增加了大豆转基因复合植株根瘤苹果酸浓度。在促进根系结瘤方面的功能：与对照相比，超量表达GmMDH12显著增加了大豆转基因复合植株的根瘤数和根瘤生物量，提高了植株氮含量和生物量。因此，提供了基因GmMDH12本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种大豆GmMDH12基因，其特征在于，序列如SEQ ID NO.3所示。

【技术特征摘要】
1.一种大豆GmMDH12基因，其特征在于，序列如SEQIDNO.3所示。2.权利要求1所述GmMDH12基因编码蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。3.权利要求1所述GmMDH12基因在增强豆科植物根瘤苹果酸合成方面的应用。4.权利要求1所述GmMDH12基因在促进豆科植物结瘤固氮能力方面的应用。5.权利要求1所述GmMDH12基因在培育根系结瘤能力和/或生物固氮能力强的豆科植物方面的应用。6.根据权利要求3～5任一所述应用，其特征在于，所述豆科植物为大豆。7.一种构建根系结瘤能力和/或生物固氮能力强的转基因大豆的方法，其特征在于，将GmMDH12基因在大豆中过表达。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，将GmMDH12基因连接到载体PTF101S上得超量表达载体后，转入K599中，...

【专利技术属性】
技术研发人员：田江，陈志坚，廖红，梁翠月，白振龙，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44