本发明专利技术公开了一种硝基还原酶基因cnrB及其硝基还原酶和应用，该基因cnrB的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，该基因cnrB编码的硝基还原酶CnrB的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。本发明专利技术克隆到一种硝基还原酶基因cnrB，该基因为一种氯霉素硝基还原酶基因，比对结果表明该基因为一个新的基因，全长为744bp，编码247个氨基酸；本发明专利技术硝基还原酶基因cnrB编码的硝基还原酶CnrB能够将氯霉素中的硝基还原成氨基，该硝基还原酶CnrB可用于环境中氯霉素残留的去除及药物合成的生物转化，以及转基因作物的构建，具有非常重要的理论和应用价值。
【技术实现步骤摘要】
一种硝基还原酶基因cnrB及其编码的蛋白和应用
本专利技术属于应用环境微生物和农业领域，涉及硝基还原酶基因cnrB及其编码硝基还原酶和应用，具体涉及抗生素氯霉素的硝基还原酶基因cnrB及其硝基还原酶和应用。
技术介绍
氯霉素(chloramphenicol，CAP)由StreptomycesVenezuela的代谢所得，是一种应用广泛的抗生素，能够很好地抑制肠杆菌科细菌及炭疽杆菌的生长，对传染性厌氧菌引发的疾病有特效治疗效果。氯霉素不仅具备良好的抗菌作用且易于大规模生产，因此被普遍用于人类以及动物的多类疾病治疗。但氯霉素存在诱使机体病变、癌变的风险，已有医学研究表明它会对人类造血以及消化系统造成严重的毒性损害。且氯霉素及其分解产物会从土壤迁移进入地下水，造成生产生活水源污染，这些物质被人体吸收后会引起血液红细胞减少、贫血、消化系统和神经系统肌肉的紊乱以及婴儿的灰色综合症等不良反应。美国食品与药品管理局(FDA)2002年颁布了禁止在进口动物源性贸易品中使用氯霉素的法规，欧盟(EU)卫生标准规定不得在进口食品中检测到氯霉素。但由于其代谢动力学特性良好、易于获得和价格低廉等原因，依然有人在畜禽养殖业中大量使用氯霉素。畜禽养殖业中使用的氯霉素，随着养殖粪便废水进入环境，加之氯霉素性质稳定，能在环境中长期存在，会导致诸如抗药性基因转移、破坏环境生态平衡等诸多问题，并威胁到人类的生存和健康。获得氯霉素的降解基因在治理环境中的氯霉素残留的技术研发中具有以下作用和功能，(一)用于畜禽养殖场废水和环境水体中氯霉素的降解与去除，(二)用于有用化工产品及药物合成的生物转化。因此该降解基因在消除该类抗生素残留危害的研究中具有非常重要的理论和应用价值。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有技术存在的问题，本专利技术提供一种硝基还原酶基因cnrB，该基因为一种氯霉素硝基还原酶基因，是一个全新的硝基还原酶基因，该基因编码的硝基还原酶CnrB能够在还原力NADPH存在条件下将氯霉素化学结构式中的硝基还原成氨基。本专利技术还提供该硝基还原酶基因cnrB编码的硝基还原酶及其应用。技术方案：为了实现上述目的，如本专利技术所述一种硝基还原酶基因cnrB，所述基因cnrB的核苷酸序列为SEQIDNO.1。本专利技术所述的硝基还原酶基因cnrB编码的硝基还原酶CnrB，所述硝基还原酶CnrB的氨基酸序列为SEQIDNO.2。含有本专利技术所述的硝基还原酶基因cnrB的重组表达载体pET28a-cnrB。所述重组表达载体pET28a-cnrB由硝基还原酶基因cnrB插入载体pET-28a(+)的NcoI和XhoI位点之间所得。含有本专利技术所述的硝基还原酶基因cnrB的基因工程菌。所述的基因工程菌是将权利要求3所述的重组载体pET28a-cnrB导入大肠杆菌Rosetta(DE3)获得。本专利技术所述的硝基还原酶基因cnrB在降解和转化氯霉素中的应用。本专利技术所述的硝基还原酶CnrB在降解和转化氯霉素中的应用。本专利技术所述的在降解和转化氯霉素中的应用。所述硝基还原酶CnrB在降解和转化水体、土壤中氯霉素残留的应用。此外，所述硝基还原酶基因cnrB还可以应用在构建降解氯霉素的转基因作物中。所述的重组表达载体pET28a-cnrB应用在构建降解氯霉素的转基因作物中。本专利技术硝基还原酶基因cnrB是在一株氯霉素降解菌种中克隆得到，所用降解氯霉素的菌株为类诺卡氏菌LMS-CY，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNO:M2016591，保藏日期2016年10月24日，该菌株在专利(CN106754578A)中已经保藏。本专利技术克隆该基因采取的策略为全基因组测序比对筛选目的基因，提供比对筛选出的原始序列，设计引物，通过PCR扩增基因，胶回收试剂盒纯化后，采用双酶切获得目的片段。有益效果：与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：1、本专利技术从一种氯霉素降解菌株LMS-CY中成功克隆到一种硝基还原酶基因cnrB，该基因为一种氯霉素硝基还原酶基因，在GenBank比对结果表明该基因为一个新的基因，全长(从起始密码子到终止密码子)为744bp，编码247个氨基酸，基因cnrB是首个公开的能降解氯霉素的降解基因，同时也是能催化还原苯环上硝基的新型氯霉素硝基还原酶基因。2、本专利技术通过PCR技术扩增末端含NcoI和XhoI位点的完整的氯霉素硝基还原酶基因片段，将它连接到大肠杆菌高效表达载体pET-28a(+)的NcoI和XhoI酶切位点上，转化表达宿主菌Rosetta(DE3)，进行IPTG诱导后可以高效表达。3、本专利技术硝基还原酶基因cnrB编码的还原酶硝基CnrB能在够在还原力NADPH存在条件下将氯霉素结构式中的硝基还原成氨基，该硝基还原酶CnrB可用于环境中氯霉素残留的去除及药物合成的生物转化，具有非常重要的理论和应用价值。4、本专利技术对氯霉素硝基还原酶基因基因表达的产物(即硝基还原酶)，进行酶活性测定，能高效的降解氯霉素，1h能对100mg/L氯霉素的降解率为83.5％。5、通过本专利技术的基因构建的工程菌株能高效表达氯霉素硝基还原酶，生产的酶制剂可用于水体、土壤中氯霉素残留的降解或转化。附图说明图1为硝基还原酶基因cnrB的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图；图2为pET28a-cnrB质粒PCR鉴定琼脂糖凝胶电泳图；图3为硝基还原酶基因cnrB在Rosetta(DE3)中表达策略图；图4为重组菌株Rosetta(DE3)/pET28a-cnrB全菌表达鉴定SDS-PAGE蛋白电泳图；图5为CnrB蛋白Ni-IDA纯化蛋白电泳图谱；图6为硝基还原酶CnrB降解氯霉素HPLC图；图7为氯霉素硝基还原酶CnrB催化降解氯霉素的LC/MS/MS图谱；A：氯霉素的酶降解产物总离子流图谱；B：保留时间为4.965min的物质一级质谱图；C：保留时间为4.965min的物质二级质谱图；图8为氯霉素的LC/MS/MS图谱；A：氯霉素的总离子流图谱；B：保留时间为4.976min的物质一级质谱图；C：保留时间为4.976min的物质二级质谱图；图9氯霉素硝基还原酶CnrB降解氯霉素的途径。具体实施方式以下结合附图和实施例作进一步说明。实施例中使用的微生物来源如下：NcoI、XhoI购自宝生物工程(南京)有限公司；大肠杆菌感受态TOP10购自宝生物工程(南京)有限公司；大肠杆菌高表达载体pET-28a(+)购自Novegen公司；表达宿主菌大肠杆菌Rosetta(DE3)购自上海英骏生物技术有限公司。实施例1菌株LMS-CY的培养以及氯霉素硝基还原酶基因cnrB的克隆菌株LMS-CY，经鉴定为类诺卡氏菌属(Nocardioidessp.)，已保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏时间为2016年10月24日，保藏编号为CCTCCNO:M2016591，该菌株在专利(CN106754578A)中已经保藏。1、细菌基因组总DNA的提取LB培养基配方(1L)为：NaCl10g，蛋白胨10g，酵母膏5g，pH7.2-7.5。将菌株LMS-CY(CCTCCNO:M2016591)在LB培养基中大量培养后，采用CTAB法提取高纯度、大片段的LMS-CY的基因组总DNA，溶于TE缓冲液(pH8.0)中，置于－20本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种硝基还原酶基因cnrB，其特征在于，所述基因cnrB的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。
【技术特征摘要】
1.一种硝基还原酶基因cnrB，其特征在于，所述基因cnrB的核苷酸序列为SEQIDNO.1。2.一种权利要求1所述的硝基还原酶基因cnrB编码的硝基还原酶CnrB，其特征在于，所述硝基还原酶CnrB的氨基酸序列为SEQIDNO.2。3.一种含有权利要求1所述的硝基还原酶基因cnrB的重组表达载体pET28a-cnrB。4.根据权利要求1所述的重组表达载体pET28a-cnrB，其特征在于，所述重组表达载体pET28a-cnrB由硝基还原酶基因cnrB插入载体pET-28a(+)的NcoI和XhoI位点之间所得。5.一种含有权利要...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄星，鲁璐瑶，蒋建东，田云龙，朱昌雄，
申请(专利权)人：南京农业大学，中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所，
类型：发明
国别省市：江苏,32
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。