本发明专利技术属于分子生物学中的基因工程领域，具体涉及一种草莓花青苷相关基因FvMYB17及其应用，FvMYB17的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示；研究表明该基因具有促进拟南芥花青苷合成的功能。本发明专利技术为利用基因工程技术，对果实色泽的调控提供了理论依据与技术手段，具有很大的应用价值。
【技术实现步骤摘要】
一种草莓花青苷相关基因FvMYB17及其应用
本专利技术属于分子生物学、基因工程
，具体涉及一种草莓花青苷相关基因FvMYB17及其应用。
技术介绍
草莓是多年生草本植物，蔷薇科草莓属，是世界上消费量最大的浆果之一。草莓属于生长周期短、容易繁殖、植株较小、方便管理的一种水果(谭昌华等，2003)。由于草莓果实特殊的香气和极高的营养价值，因此受到广大消费者的喜爱。草莓果实中存在着大量花青苷，从而导致果实颜色的变化。同时MYB转录因子在植物的次生代谢中有极其重要的作用。MYB转录因子因其含有一段保守的Myb结构域而得名，它的N端是高度保守的，且含有不完全重复的串联的1-3个R结构域，即R1、R2和R3。根据所含R数量不同可将其分为以下4类：1R-MYB(MYB-related)，R2R3-MYB，3R-MYB，4R-MYB(牛义岭等，2016)。每个R可形成3个α-螺旋，其中第2、3个α-螺旋形成螺旋-转角-螺旋(王希庆等，2003)，第三个螺旋可以识别染色体的大沟。每一个MYB结构域中含有17-19个氨基酸间隔开的3个保守的色氨酸残基，它们具有疏水作用并且对维持螺旋-转角-螺旋有重要的作用。模式植物拟南芥中R2R3-MYB家族的第四亚族包括AtMYB3、AtMYB4、AtMYB6和AtMYB7基因。Jin(2000)发现AtMYB4拟南芥突变体对UV-B的耐受性增强。与上述基因同源的另一个基因AtMYB7在拟南芥中也可能作为一个新的紫外线保护因子(Fornaléetal.，2014)。通过前人研究可以看出，拟南芥MYB家族的第四亚组中主要在负调控类黄酮和紫外线保护有重要作用。但是我们发现草莓FvMYB17能够促进花青苷的合成，这与模式植物拟南芥中同源基因的功能完全不同。对该基因进行功能研究，阐明其花青苷调控机理，可以有利于在分子方面了解草莓花青苷的合成。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的不足，提供一种花青苷合成基因-草莓基因FvMYB17及其应用。本专利技术的技术方案是从二倍体森林草莓‘Ruegen’中分离得到FvMYB17基因,构建该基因的植物过表达载体，通过农杆菌介导法，将该基因转化到拟南芥中，以实现FvMYB17基因的功能分析。本专利技术提供了一种草莓花青苷相关基因FvMYB17，该基因的cDNA序列如SEQNO.1所示；草莓花青苷合成相关基因FvMYB17编码的蛋白质，所述基因编码的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示；本专利技术提供一种用于扩增草莓花青苷相关基因FvMYB17的引物，包含：FvMYB17-F:5＇－AAAGGTACCATGAGGAAACCCTGCTGCGA－3＇FvMYB17-R:5＇－AAAGAATTCTCTGAAGAGAGGAAGCGTGG－3＇其中，引物5＇端的前3个碱基为保护碱基，紧接着的6个碱基是酶切位点，5＇端前9个碱基是构建过表达载体所需，不属于FvMYB17的基因序列。FvMYB17-R引物由于构建GFP融合表达载体需要，去掉了终止密码子。本专利技术提供一种草莓花青苷相关基因FvMYB17的植物过表达载体，所述载体为pRI101-GFP-CaMV35S-FvMYB17。本专利技术提供一种草莓花青苷相关基因FvMYB17在提高植物花青苷含量的应用。本专利技术提供一种表达载体pRI101-GFP-CaMV35S-FvMYB17在提高植物花青苷含量的应用。本专利技术还提供了一种含有草莓花青苷基因FvMYB17的植物表达载体pRI101-CaMV35S-FvMYB17-GFP，将其通过农杆菌介导的方法转入拟南芥中。实际上，任何一种将外源基因导入植物体内的表达载体都可以用，本专利技术优先选用的是的pRI101-CaMV35S-GFP。本专利技术的有益效果是：利用现有植物基因工程技术，本专利技术克隆了草莓花青苷相关基因FvMYB17,并通过农杆菌介导的转化方法将该基因转入拟南芥，经过比较分析证明，转基因植株叶片中的花青苷含量明显提高。附图说明图1：FvMYB17基因cDNA序列的扩增结果。其中M为DL2000图2：Kpn1和EcoR1对pRI101-CaMV35S-FvMYB17-GFP重组载体双酶切验证结果。其中M为DL2000。图3：为正常生长条件下转基因植株和野生型的生长状况。其中WT为未转化的拟南芥，OE-1/OE-2为两个独立的转基因株系。具体实施方式：实施例1、草莓花青苷合成基因FvMYB17的克隆(1)以二倍体森林草莓‘Ruegen’为试材。(2)RNA提取：采用改良CTAB法，提取材料中的总RNA之后用反转录试剂盒以RNA为模板反转录得到cDNA第一链。(3)基因的克隆：以反转录的果实cDNA第一链为模板，利用引物FvMYB17-F和FvMYB17-R进行PCR扩增，回收PCR产物，获得765bp的目的片段。FvMYB17-F:5＇－AAAGGTACCATGAGGAAACCCTGCTGCGA－3＇FvMYB17-R:5＇－AAAGAATTCTCTGAAGAGAGGAAGCGTGG－3＇其中，引物5＇端的前3个碱基为保护碱基，紧接着的6个碱基是酶切位点，5＇端前9个碱基是构建过表达载体所需，不属于FvMYB17的基因序列。实例2、植物表达载体的构建(1)利用植物表达载体pRI101-CaMV35S-GFP，选用Kpn1和EcoR1(购自TaKaRa公司)分别对pRI101-CaMV35S-GFP和含有目的基因的PMD18-T(购自TaKaRa公司)进行双酶切；回收载体大片段和目的基因小片段，用T4DNA连接酶连接过夜后转化大肠杆菌感受态DH5a(购自北京全式金生物技术有限公司)，鉴定重组子后即可进行双酶切验证。(2)选取双酶切验证正确的重组质粒，送金唯智生物科技有限公司测序。之后转化农杆菌GV3101感受态细胞，得到的含有重组质粒的农杆菌用于转化拟南芥。实例3、转基因功能验证—拟南芥转化筛选及表型分析3.1拟南芥转化当拟南芥(哥伦比亚野生型)花序形成时，将花序顶端减掉以诱导侧花序的生成，转化前将材料浇透水。挑选含有目的基因FvMYB17的农杆菌GV3101阳性克隆。接种于含有Kan(卡那霉素)50mg/L和Rif(利福平)25mg/L的YEP液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养24h，取1ml培养好的菌液，加入50ml液体YEP液体培养基，放置于28℃，200rpm振荡培养，使OD600＝0.8左右。将菌液转入无菌的50ml离心管中，5000rpm，5min离心收集菌种，再用同等体积的MS重悬液(1/2MS+5％Sucrose，pH＝5.7)重悬农杆菌，并加入表面活性剂Silwet。一个月后收获了T0代种子在含有30mg/L的卡纳霉素的培养基上筛选出阳性植株，以便收获T1代种子，用于后期观察表型。3.2拟南芥阳性株系表型鉴定将转基因拟南芥T2代植株(带有pRI101-CaMV35S-FvMYB17-GFP表达载体的转基因拟南芥)和野生型拟南芥在同等条件下(16h光照/8h黑暗)条件下进行培养。7周之后采集WT和转基因植株的叶片，进行花青苷总量的测定，测定结果如表1所示。表1：表型花青苷含量(nmol/gFW)野生型拟南芥0.26±0.05转基因株系OE-10.87±0.16本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.草莓花青苷相关基因FvMYB17用于提高植物中花青苷含量的用途，其特征在于：所述FvMYB17的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
【技术特征摘要】
1.草莓花青苷相关基因FvMYB17用于提高植物中花青苷含量的用途，其特征在于：所述FvMYB17的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。2.根据权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：张俊祥，石伟佳，张志宏，王保田，雷莹莹，于双，
申请(专利权)人：沈阳农业大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21
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