本发明专利技术公开了一种翘嘴鳜IL‑6基因及其抗病SNP标记的检测方法。本发明专利技术克隆了翘嘴鳜IL‑6基因cDNA序列，如SEQ ID NO：1所示。在此基础上进一步克隆出含翘嘴鳜IL‑6基因内含子的IL‑6 gDNA序列，如SEQ ID NO：2所示。根据IL‑6 gDNA序列设计用于扩增抗病SNP位点的引物，扩增翘嘴鳜IL‑6基因获得扩增产物，并对扩增产物进行测序并找出与病毒疾病抗性相关的SNPs位点，根据DNA峰形图确定出SNP位点。本发明专利技术首次克隆到了翘嘴鳜IL‑6 cDNA全长序列、IL‑6 gDNA全长序列，为鱼类的抗病选育等工作提供研发基础；并且，本发明专利技术检测到了鳜鱼IL‑6基因与病毒疾病抗性相关的SNP位点，为翘嘴鳜的选育工作提供新思路，有利于推进翘嘴鳜的遗传育种进程，提高鳜鱼养殖经济效益。
【技术实现步骤摘要】
一种翘嘴鳜IL-6基因及其抗病SNP标记的检测方法
本专利技术属于水产养殖、生物
，尤其涉及一种翘嘴鳜IL-6基因及其抗病SNP标记的检测方法。
技术介绍
翘嘴鳜(Sinipercachuatsi)作为我国具有重要经济价值的“名特优”鱼类，在我国的淡水养殖中占据重要地位，然而在近几年的大规模人工养殖条件下，翘嘴鳜的种质退化现象比较普遍，导致抗病能力逐渐下降，尤其是病毒性疾病日益猖獗，而且至今未有十分有效的防治方法，每年都造成严重的经济损失，严重制约了其养殖业的可持续发展。现有鱼类选育技术是根据肉眼观察到的鱼类表观性状对鱼类进行选育，无法从与表观性状密切相关的基因差异角度对鱼类进行正确的选育，不仅无法开展早期选育、后代的性状难以保证，而且选育的盲目性大、费时费力。开展与抗病相关基因的克隆，并利用SNP分子标记检测或筛选抗病的翘嘴鳜种质资源，进而选育出抗病种群，是提高翘嘴鳜对病毒性等疾病抗性的有效手段。其中，SNPs(signalnucleotidepoly-morphisms)，即单核苷酸多态性。基因片段上单个碱基发生转换、颠换、插入或缺失，会使得SNP表现出多态性，也会导致生物个体间的抗病性表型出现差异。在抗病相关基因中，IL-6(白细胞介素-6，简称白介素6)，是属于白细胞介素的一种细胞因子，能够促进参与免疫反应的各种细胞的增殖和分化，并且提高其功能，同时还会抑制细胞的凋亡。但目前有关鱼类IL-6基因克隆和功能的相关研究还很缺乏，这是由于鱼类和其他物种的IL-6基因序列的同源性很低，而且IL-6基因的转录和翻译过程在受到免疫刺激时会很不稳定，导致鱼类细胞因子的cDNA文库克隆成果较少。因此，克隆翘嘴鳜IL-6的cDNA全长序列、gDNA全长序列具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种翘嘴鳜抗病基因IL-6基因(白细胞介素-6，IL-6)，旨在解决鱼类与其他物种IL-6基因的同源性很低，而有关鱼类IL-6基因缺乏的问题。本专利技术的再一目的在于提供翘嘴鳜抗病SNP标记的检测方法，该方法以本专利技术所发现的翘嘴鳜IL-6基因为基础，利用单核苷酸多态性(SNP)与鱼类抗病表观性状相结合，以抗病或非抗病鱼类IL-6的SNP标记(或称突变位点)为依据，可精准选育出抗病鱼类种群，提高优种选育的工作效率，降低选育鱼类的发病率和死亡率，进而增加鱼类养殖的经济效益，这对于鱼类选育的技术进步具有非常重要的意义。本专利技术是这样实现的，一种翘嘴鳜IL-6基因，该基因的cDNA序列如SEQIDNO：1所示。本专利技术进一步公开了基于上述翘嘴鳜IL-6基因的抗病SNP标记的检测方法，该方法包括以下步骤：(1)根据含翘嘴鳜IL-6基因的内含子的IL-6gDNA序列设计用于扩增抗病SNP位点的引物，扩增翘嘴鳜IL-6基因获得扩增产物；(2)对扩增产物进行测序并找出与病毒疾病抗性相关的SNPs位点，根据DNA峰形图确定出SNP位点。优选地，在步骤(1)中，所述IL-6gDNA序列通过对翘嘴鳜IL-6基因设计特异性引物并扩增获得，该IL-6gDNA序列的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。优选地，所述特异性引物为：IL-6-1F：5’-CTCAGCATCAGCGGAAACTC-3’；IL-6-1R：5’-TGCCCCTGTTGGCCATACTT-3’。优选地，在步骤(1)中，所述翘嘴鳜IL-6基因通过cDNA末端快速扩增RACE技术克隆得到。优选地，在步骤(1)中，所述扩增抗病SNP位点的引物为：IL-6-L1F：5’-AACCCAAAGAGGCAGGTGAC-3’；IL-6-L1R：5’-ACCATCCAATTTCCCTGAGGT-3’。优选地，在步骤(2)中，通过DNAMAN软件对测序结果做多序列比对并找出疑似SNPs位点，根据Chromas软件查看DNA峰形图，判断是否为套峰以确定出SNP位点。相比于现有技术的缺点和不足，本专利技术具有以下有益效果：(1)本专利技术首先克隆到了翘嘴鳜IL-6cDNA全长序列、IL-6gDNA全长序列，为鱼类的抗病选育等工作提供研发基础；(2)本专利技术检测到了鳜鱼IL-6基因与病毒疾病抗性相关的SNP位点，为翘嘴鳜的选育工作提供新思路，有利于推进翘嘴鳜的遗传育种进程，提高鳜鱼养殖经济效益。附图说明图1是翘嘴鳜IL-6基因各阶段扩增后的凝胶电泳结果；其中，图1(A)是翘嘴鳜IL-6基因cDNA5’端RACE第二轮PCR琼脂糖凝胶电泳结果，泳道1为目的片段；图1(B)翘嘴鳜IL-6基因cDNA3’端RACE第二轮PCR琼脂糖凝胶电泳结果，泳道1为目的片段；图2是加入内含子所用的引物进行翘嘴鳜IL-6基因PCR扩增后的凝胶电泳结果；图3是翘嘴鳜IL-6基因SNP位点检测PCR扩增后的凝胶电泳结果；图4是翘嘴鳜头肾组织传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)PCR检测结果；其中，泳道①DL500Mark电泳后得到的条带；泳道②③均为以ISKNV病毒感染组翘嘴鳜头肾组织匀浆液制备的模板PCR扩增、电泳得到单一明亮的ISKNV病毒核苷酸特异性条带(187bp)；其它泳道为感染组翘嘴鳜头肾组织匀浆液制备的模板PCR扩增、电泳未见特异性条带；图5是在22组翘嘴鳜样品的IL-6DNA反向互补序列进行比较后的结果截图；其中，有3个样品的碱基G突变为碱基A；图6是基因测序仪器对翘嘴鳜样品的IL-6DNA测序时所生成的DNA峰形图，该图中翘嘴鳜样品的IL-6DNA未突变G纯合子；图7是基因测序仪器对翘嘴鳜样品的IL-6DNA测序时所生成的DNA峰形图，该图中翘嘴鳜样品的IL-6DNA未突变G杂合子；图8是基因测序仪器对翘嘴鳜样品的IL-6DNA测序时所生成的DNA峰形图，该图中翘嘴鳜样品的IL-6DNA突变为A纯合子。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。一、翘嘴鳜IL-6cDNA序列的克隆1、翘嘴鳜IL-65’端序列的扩增(1)cDNA第一链的合成、纯化及加尾用SUPERSCRIPTIIRT酶、引物GSP-IL-6-1对已提取的总RNA进行IL-6第一链cDNA的合成。使用RNaseMix对合成的cDNA进行去RNA处理。其中，反转录体系为：70℃孵育10分钟，立刻置于冰上冷却1分钟，短暂离心收集液体，继续添加如下体系：轻轻混匀后离心，42℃孵育1分钟，再添加1μlSUPERSCRIPTIIRT，混匀后42℃孵育50分钟后，70℃孵育15分钟停止反应，离心后置于37℃，添加RNasemix1μl，反应30分钟，对其进行纯化后，用TdT酶和dCTP对纯化后的cDNA末端加上poly(c)后，低温保存备用。(2)cDNA5’末端快速扩增使用引物GSP-IL-6-2对已经加dC尾的cDNA进行PCR第一轮扩增，按如下顺序添加5’-RACE反应体系：PCR反应程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃重新分析退火30s，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃终延伸7min。使用引物GSP-IL-6-3和桥连通用扩增引物AUAP进行巢式PCR第二轮扩增，体系如下：PCR反应程序本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种翘嘴鳜IL‑6基因，其特征在于，该基因的cDNA序列如SEQ ID NO：1所示。
【技术特征摘要】
1.一种翘嘴鳜IL-6基因，其特征在于，该基因的cDNA序列如SEQIDNO：1所示。2.一种基于权利要求1所述的翘嘴鳜IL-6基因的抗病SNP标记的检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)根据含翘嘴鳜IL-6基因内含子的IL-6gDNA序列设计用于扩增抗病SNP位点的引物，扩增翘嘴鳜IL-6基因获得扩增产物；(2)对扩增产物进行测序并找出与病毒疾病抗性相关的SNPs位点，根据DNA峰形图确定出SNP位点。3.如权利要求2所述的抗病SNP标记的检测方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述IL-6gDNA序列通过对翘嘴鳜IL-6基因设计特异性引物并扩增获得，该IL-6gDNA序列的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。4.如权利要求3所述的抗病SNP标记的...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄鹤忠，路瑶，金锐铭，李泽，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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