一种用于低丰度DNA突变的富集技术及其应用制造技术

本发明专利技术属于分子生物学领域，公开了一种用于低丰度DNA突变的富集引物、富集方法及试剂盒，用于低丰度DNA突变的检测方法及检测试剂盒。本发明专利技术基于PCR原理富集低丰度DNA突变，富集引物的正向引物包括2条短引物，长度为10‑16nt，2条短引物中AF引物可与野生型和突变型模板均匹配。AR引物设计有与突变位点互补的碱基，位于AR引物的中间位置或中间偏5’端位置，且AR引物3’端修饰有MGB基团。AF引物3’端与AR引物5’端与模板结合的位置间隔0‑5个碱基。本发明专利技术所述富集方法可将丰度在万分之一的突变型模板富集100～1000倍，富集产物可用多种方法进行后续分析，操作简单，应用灵活，灵敏度高。

【技术实现步骤摘要】
一种用于低丰度DNA突变的富集技术及其应用
本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种用于低丰度DNA突变的富集技术及其应用，尤其是涉及一种用于低丰度DNA突变的富集引物、富集方法及试剂盒，用于低丰度DNA突变的检测方法及检测试剂盒。
技术介绍
检测生物样本中低丰度DNA突变或微量等位基因在肿瘤早期筛查，产前诊断等领域具有重要意义。目前基于PCR检测低丰度DNA突变的技术主要有ARMS-PCR技术(amplificationrefractorymutationsystemPCR)、基于酶切的PCR富集技术、基于连接的PCR富集技术、基于Blocker阻碍的PCR富集技术、低变性温度的复合PCR富集技术(co-amplificationatlowerdenaturationtemperaturePCR，COLD-PCR)以及DigitalPCR技术。ARMS-PCR技术是目前应用较广泛且较成熟的技术，该技术是将引物的3’端设为突变位点，当引物与突变型模板结合时才能启动扩增反应，与野生型模板结合时不能进行扩增或扩增效果弱，从而达到突变型与野生型的差异扩增，但该方法选择性一般为10-1～10-3，检测灵敏度低。基于酶切和连接的PCR富集技术检测成本比较低廉，但操作步骤复杂，且检测周期长，一般采用电泳检测或与Sanger测序相结合，选择性一般为10-2～10-4。COLD-PCR技术是基于杂交双链与完全互补双链有不同的变性温度，杂交链变性临界温度(Tc)低于完全互补双链的变性温度(Tm)，且Tc依赖于DNA序列，当PCR退火温度设为Tc时，突变型与野生型的杂交链解链，可使引物与其结合，进行扩增；而同源双链不变性，引物不能结合，不扩增，从而达到突变型和野生型的差异扩增，但该方法对温度极为敏感，对仪器要求比较严苛。DigitalPCR技术是目前最常用的检测低丰度突变的技术，该方法可进行绝对定量，操作简单、突变选择性可达10-4～10-5，但该方法需要特定的仪器支持，成本高昂。肺癌是目前发病率和死亡率增长最快、对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。而在所有肺癌患者中约有80％为非小细胞肺癌(NSCLC)，这其中约有20％的表皮生长因子受体(EGFR)发生突变。其中，L858R和T790M突变已成为非小细胞肺癌的研究热点，其主要检测方法是ARMS-PCR和测序，但两种技术检测灵敏度均较低，对血液中游离的核酸中突变难以检测。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于针对现有技术的缺陷，提供一种灵敏度高、特异性好、操作简单的用于低丰度DNA突变富集的引物、富集方法及试剂盒。为实现本专利技术的目的，本专利技术采用如下技术方案。一种用于低丰度DNA突变的富集引物，包括正向引物，所述正向引物由AF引物和AR引物组成，AF引物和AR引物长度均为10-16nt，AF引物位于AR引物的上游，AF引物3’端与AR引物5’端与模板结合的位置间隔0-5个碱基；AF引物与野生型模板和突变型模板均匹配，AR引物与突变型模板完全互补配对；AR引物中与突变位点互补的碱基位于AR引物的中间位置或中间偏5’端位置；AR引物3’端修饰有MGB基团。本专利技术所述用于低丰度DNA突变的富集引物中的正向引物包括2条短引物，长度为10-16nt，2条短引物分别命名为AF引物和AR引物，AF引物可与野生型和突变型模板均匹配。AR引物设计有与突变位点互补的碱基，位于AR引物的中间位置或中间偏5’端位置。AR引物可与突变型模板完全互补配对，与野生型模板有一个突变碱基的不匹配，使其与突变型和野生型模板结合效率不同，且AR引物3’端修饰有MGB基团。AF引物3’端与AR引物5’端与模板结合的位置间隔0-5个碱基。由于AF引物和AR引物2条引物较短，长度为10-16nt，其与模板结合效果较差，甚至不结合，因此当任一条引物在体系中单独存在时，不能启动聚合酶链式反应。只有当两条引物同时存在时，当AR引物与模板结合后，AF引物在碱基堆积力的作用下，即可与模板结合，启动扩增反应。由于AR引物3’端修饰有MGB基团，使其不能启动扩增反应，因此，本专利技术中可检测的突变为真实的突变，而非引物引入突变。本专利技术主要通过AR引物与突变型和野生型模板的差异结合，达到对突变型的选择性扩增，从而在低丰度混合模板中达到富集突变型模板的目的。进一步的，本专利技术所述用于低丰度DNA突变的富集引物还包括反向引物R。所述反向引物长度为19-30nt，可与模板的正链即有义链，也称编码链结合的引物。基于非小细胞肺癌T790M突变检测存在的问题，本专利技术提供了一种用于低丰度人T790MDNA突变的富集引物，包括正向引物，所述正向引物由T790M-AF引物和T790M-AR引物组成。所述T790M-AF引物核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述T790M-AR引物核苷酸序列如SEQIDNo.2所示且3’端修饰有MGB基团，所述T790M-AF引物的3’端与所述T790M-AR引物的5’端与模板的结合位置间隔3个碱基。进一步的，所述用于低丰度人T790MDNA突变的富集引物，还包括反向引物T790M-R，其核苷酸序列如SEQIDNo.3所示。具体的，各引物序列如下所示：T790M-AF(11nt)：5’-CTCCACCGTGC-3’(SEQIDNo.1)；T790M-AR(14nt)：5’-TCATCATGCAGCTC-3’(SEQIDNo.2)；T790M-R(28nt)：5’-CAGACCACACTGAGCACTCAATAAAGAG-3’(SEQIDNo.3)；其中，T790M-AR引物中加下划线粗体的碱基为突变碱基，且T790M-AR引物的3’端修饰有MGB基团，该引物与T790M突变型模板可以完全互补配对结合，与T790M野生型模板有一个碱基C>T的突变，不能与野生型模板完全互补配对。T790M-AF的3’端与T790M-AR的5’端与模板的结合位置间隔3个碱基。基于非小细胞肺癌L858R突变检测存在的问题，本专利技术提供了一种用于低丰度人L858RDNA突变的富集引物，包括正向引物，所述正向引物由L858R-AF引物和L858R-AR引物组成，所述L858R-AF引物核苷酸序列如SEQIDNo.4所示，所述L858R-AR引物核苷酸序列如SEQIDNo.5所示且3’端修饰有MGB基团，所述L858R-AF引物的3’端与所述L858R-AR引物的5’端与模板的结合位置间隔4个碱基。进一步的，所述用于低丰度人L858RDNA突变的富集引物，还包括反向引物L858R-R，其核苷酸序列如SEQIDNo.6所示。具体的，各引物序列如下所示：L858R-AF(15nt)：5’-ATGTCAAGATCACAG-3’(SEQIDNo.4)；L858R-AR(12nt)：5’-TGGGCGGGCCAA-3’(SEQIDNo.5)；L858R-R(25nt)：5’-CCTCATTCACTGTCCCAGCAAGTAC-3’(SEQIDNo.6)；其中，L858R-AR引物中加下划线粗体的碱基为突变碱基，且L858R-AR引物的3’端修饰有MGB基团，该引物与L858R突变型模板可以完全互补配对结合，与L858R野生型模板有一本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于低丰度DNA突变的富集引物，包括正向引物，所述正向引物由AF引物和AR引物组成，AF引物和AR引物长度均为10‑16nt，AF引物位于AR引物的上游，AF引物3’端与AR引物5’端与模板结合的位置间隔0‑5个碱基；AF引物与野生型模板和突变型模板均匹配，AR引物与突变型模板完全互补配对；AR引物中与突变位点互补的碱基位于AR引物的中间位置或中间偏5’端位置；AR引物3’端修饰有MGB基团；还包括反向引物R，长度为19‑30nt。

【技术特征摘要】
1.一种用于低丰度DNA突变的富集引物，包括正向引物，所述正向引物由AF引物和AR引物组成，AF引物和AR引物长度均为10-16nt，AF引物位于AR引物的上游，AF引物3’端与AR引物5’端与模板结合的位置间隔0-5个碱基；AF引物与野生型模板和突变型模板均匹配，AR引物与突变型模板完全互补配对；AR引物中与突变位点互补的碱基位于AR引物的中间位置或中间偏5’端位置；AR引物3’端修饰有MGB基团；还包括反向引物R，长度为19-30nt。2.根据权利要求1所述的富集引物，其特征在于，当所述DNA突变为人T790MDNA突变时，所述用于低丰度人T790MDNA突变的富集引物，包括正向引物，所述正向引物由T790M-AF引物和T790M-AR引物组成，所述T790M-AF引物核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述T790M-AR引物核苷酸序列如SEQIDNo.2所示且3’端修饰有MGB基团，所述T790M-AF引物的3’端与所述T790M-AR引物的5’端与模板的结合位置间隔3个碱基；还包括反向引物T790M-R，其核苷酸序列如SEQIDNo.3所示；当所述DNA突变为人L858RDNA突变时，所述用于低丰度人L858RDNA突变的富集引物，包括正向引物，所述正向引物由L858R-AF引物和L858R-AR引物组成，所述L858R-AF引物核苷酸序列如SEQIDNo.4所示，所述L858R-AR引物核苷酸序列如SEQIDNo.5所示且3’端修饰有MGB基团，所述L858R-AF引物的3’端与所述L858R-AR引物的5’端与模板的结合位置间隔4个碱基；还包括反向引物L858R-R，其核苷酸序列如SEQIDNo.6所示。3.一种低丰度DNA突变的富集方法，以待测样本为模板，以权利要求1所述引物进行富集扩增。4.根据权利要求3所述富集方法，其特征在于，当所述DNA突变为人T790MDNA突变时，以待测样本为模板，以权利要求2所述用于低丰度人T790MDNA突变的富集引物进行富集扩增；当所述DNA突变为人L858RDNA突变时，以待测样本为模板，以权利要求2所述用于低丰度人L858RDNA突变的富集引物进行富集扩增。5.一种低丰度DNA突变的富集试剂盒，包括权利要求1所述引物。6.根据权利要求5所述的富集试剂盒，其特征在于，当所述DNA突变为人T790MDNA突变时，包括权利要求2所述用于低丰度人T790MDNA突变的富集引物；当所述DNA突变为人L858RDNA突变时，包括权利要求2所述用于低丰度人L858RDNA突变的富集引物；还包括突变富集试剂，所述突变富集试剂由dNTP、MgCl2、NH4Cl、pH8.0Tris-HCl、KCl、DNA聚合酶组成。7.一种低丰度DNA突变的检测方法，以权利要求3所述富集方法富集后的扩增产物为模板进行扩增然后进行Sanger测序。8.根据权利要求7所述检测方法，其特征在于，当所述DNA突变为人T790MDNA突变时，以权利要求4所述富集方法富集后的扩增产物为模板，以人T790M测序扩增引物进行扩增，然后以测序通用...

【专利技术属性】
技术研发人员：张岩，盖伟，邢婉丽，宋翠丹，马桂红，
申请(专利权)人：博奥生物集团有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11