普通小麦基因TaSPX3编码序列的克隆及其应用制造技术

本发明专利技术属于基因克隆技术领域，具体涉及一种普通小麦基因TaSPX3的克隆及其应用。本发明专利技术首先获得小麦基因TaSPX3的克隆，利用克隆得到的TaSPX3基因的全长cDNA序列和改造后的带GFP标签的pS1300‑GFP载体，构建TaSPX3过表达重组载体T‑P，然后以农杆菌介导花絮侵染法转化拟南芥，并将检测获得阳性突变植株经逐代的分子鉴定与自交纯合，得到T3代纯合的转基因植株，构建成TaSPX3拟南芥过表达株系，证实过表达TaSPX3基因能提高拟南芥植株的耐低磷性状，为TaSPX3基因用于作物磷高效遗传改良奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
普通小麦基因TaSPX3编码序列的克隆及其应用
本专利技术属于基因克隆
，具体涉及一种普通小麦基因TaSPX3编码序列的克隆及其应用。
技术介绍
磷在植物生长发育过程中是一个重要的大量元素，但是由于磷在土壤中易形成其不溶的沉淀，很难被作物吸收，从而降低了磷的生物有效性，土壤中的有效磷远低于作物所需要的磷含量。而小麦作为我国的主要粮食作物之一，土壤中有效磷的缺乏严重制约着小麦产量的增加，所以寻找小麦耐低磷基因已成为解决该难题的有效方法。大量研究证明SPX结构域与磷信号紧密相关，有可能在小麦的耐低磷机制中发挥重要作用。本专利技术人前期利用Affymatrix基因芯片技术筛选出水培条件下受磷胁迫强烈诱导上调表达的基因TaSPX3，该基因属于磷稳态调控密切相关的植物SPX家族，极有可能在小麦耐低磷机制中发挥重要作用。因此研究小麦TaSPX3的基因功能，提高作物对磷的利用率，能更好的为分子育种奠定基础。大量研究证明SPX结构域与磷信号紧密相关，有可能在小麦的耐低磷机制中发挥重要作用。因此研究小麦TaSPX3的基因功能，提高作物对磷的利用率，能更好的为分子育种奠定基础。小麦TaSPX基因具有双重调控角色，不但参与磷调控，还参与小麦抗病过程，这对小麦抗病及免疫调控研究提供了新的抗性基因资源。然而由于普通小麦是复杂的六倍体基因组，包括SPX基因在内的磷调节基因的功能分析及应用非常困难，现有技术缺乏一种小麦基因TaSPX3编码序列的克隆及应用。
技术实现思路
本专利技术提供的一种普通小麦基因TaSPX3编码序列的克隆及其应用，获得了小麦基因TaSPX3编码序列的克隆，提供了小麦基因TaSPX3编码序列的克隆在研究植物耐低磷机制和遗传改良中的应用。本专利技术的第一个目的是提供一种普通小麦基因TaSPX3编码序列的克隆，所述小麦基因TaSPX3编码序列的克隆是按照以下方法获得的：(1)提取小麦总RNA，并合成小麦cDNA；(2)以小麦cDNA为模板PCR扩增基因TaSPX3全长cDNA，其中，PCR扩增所用引物序列如下：TaSPX3上游引物：5’-GCTCTAGAATGAAGTTTGGGAAGAGGCTCAAG-3’；TaSPX3下游引物：5’-GGGTCGACTCAAACCACCCGGACAATACC-3’；(3)回收并纯化(2)的扩增产物中目的片段并测序鉴定，测序正确的即为小麦基因TaSPX3编码序列的克隆。本专利技术的第二个目的是提供一种所述的小麦基因TaSPX3编码序列的克隆在研究植物耐低磷机制和遗传改良中的应用。优选的，根据所述的小麦基因TaSPX3编码序列的克隆在研究植物耐低磷机制和遗传改良中的应用，先构建出改进的重组植物表达载体，重组植物表达载体上连接有小麦基因TaSPX3编码序列的克隆和GFP基因，然后将所述重组表达载体转化入植物体内，得到转化植株，利用转化植株研究小麦基因TaSPX3在植物耐低磷机制和遗传改良中的应用。优选的，根据所述的小麦基因TaSPX3编码序列的克隆在研究植物耐低磷机制和遗传改良中的应用，具体步骤如下：S1，T-TaSPX3重组质粒的构建连接所述小麦基因TaSPX3编码序列的克隆与-T载体：对纯化的小麦基因TaSPX3编码序列的克隆加A尾，得到带A尾的目的基因；然后将带A尾的目的基因与-T载体连接，得到重组质粒T-TaSPX3；S2，改进的重组植物表达载体T-P的构建利用XbaI和SalI分别对重组质粒T-TaSPX3和p1300-GFP载体进行双酶切，分别得到重组质粒T-TaSPX3双酶切产物和p1300-GFP载体双酶切产物；利用T4DNA连接酶对重组质粒T-TaSPX3双酶切产物和p1300-GFP载体双酶切产物进行连接，得到改进的重组植物表达载体T-P；S3，农杆菌侵染植物体种植野生型植物体；制备农杆菌感受态细胞；然后用重组表达载体T-P转化农杆菌感受态细胞；挑取阳性克隆的转化农杆菌侵染植物体；得到能有效克隆小麦基因TaSPX3编码序列的转基因植物体。优选的，根据上述应用，所述农杆菌为农杆菌GV3101。优选的，根据上述应用，所述植物体为拟南芥或者小麦。优选的，根据上述应用，S3中挑取阳性克隆的转化农杆菌侵染植物体后，经过3代自交，筛选出含有小麦基因TaSPX3编码序列的植物体，用于研究小麦基因TaSPX3编码序列在植物体耐低磷机制和遗传改良中的应用。与现有技术相比，本专利技术的普通小麦基因TaSPX3编码序列的克隆及其应用，具有以下有益效果：本专利技术获得了普通小麦基因TaSPX3编码序列的克隆，利用克隆得到的小麦基因TaSPX3编码序列的全长cDNA序列和改造后的带GFP标签的pS1300-GFP载体，构建TaSPX3过表达重组载体T-P，然后以农杆菌为媒介通过花絮侵染法转化拟南芥，并将检测获得阳性突变植株经逐代的分子鉴定与自交纯合，得到T3代(自交3代后的植株)纯合的转基因植株，构建成TaSPX3拟南芥过表达株系。普通小麦是复杂的六倍体基因组，包括SPX基因在内的磷调节基因的功能分析非常困难，而拟南芥植株基因组小、易于转化。所以本专利技术首先在生物信息学的基础上预测SPX基因，再利用植物表达载体使小麦TaSPX3基因在拟南芥里过量表达，通过研究生理表型及表达分析来初步明确小麦TaSPX3基因的功能，同时观察TaSPX3在转基因拟南芥中的组织定位，为之后小麦基因TaSPX3的克隆在植物体(尤其是小麦)耐低磷机制研究及遗传改良应用奠定基础。附图说明图1为小麦总RNA的电泳检测图；其中所有的泳道均为小麦总RNA样品；图2为目的小麦基因TaSPX3的全长cDNA克隆；其中M泳道为DL2000Marker；1、2泳道均为小麦基因TaSPX3的全长cDNA克隆；图3为转化大肠杆菌DH5α感受态细胞后的阳性菌落鉴定结果；其中M泳道为DL2000Marker，1-6号泳道均为阳性菌落；图4为重组质粒T-TaSPX3的PCR验证电泳结果；其中M泳道为DL2000Marker；1、2、3泳道均为重组质粒T-TaSPX3；图5为重组质粒T-TaSPX3双酶切产物和p1300-GFP载体双酶切产物的电泳图；其中M泳道为DL2000Marker；1泳道为p1300-GFP载体双酶切产物，2泳道为重组质粒T-TaSPX3载体双酶切产物；图6为重组表达载体T-P的酶切鉴定结果及质粒PCR鉴定结果；其中M泳道为DL2000Marker；1泳道为重组表达载体T-P的单酶切验证；2泳道为重组表达载体T-P的XbaI、SalI双酶切验证；3泳道为重组表达载体T-P的PCR验证；5泳道为1泳道的平行重复实验；6泳道为2泳道的平行重复实验；7泳道为3泳道的平行重复实验。图7为转基因植株的抗生素筛选图；图8为转基因植株的分子检测结果其中M泳道为DL2000Marker；1-2泳道为野生型拟南芥(TaSPX3yg)；3-4泳道为野生型拟南芥(actin2)；5-6泳道为转基因拟南芥(TaSPX3yg)；7-8泳道为转基因拟南芥(actin2)。图9为转基因拟南芥与野生型拟南芥在不同磷条件下幼苗期的生长状况；其中，图9A为缺磷处理结果、图9B为低磷处理结果、图9C为高磷处理结果；图10为14天MS中的拟南芥根部TaSPX3基因的相对表本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种普通小麦基因TaSPX3编码序列的克隆，其特征在于，所述小麦基因TaSPX3编码序列的克隆是按照以下方法获得的：(1)提取小麦总RNA，并合成小麦cDNA；(2)以小麦cDNA为模板PCR扩增基因TaSPX3全长cDNA，其中，PCR扩增所用引物序列如下：TaSPX3上游引物：5’‑GCTCTAGAATGAAGTTTGGGAAGAGGCTCAAG‑3’；TaSPX3下游引物：5’‑GGGTCGACTCAAACCACCCGGACAATACC‑3’；(3)回收并纯化(2)的扩增产物中目的片段并测序鉴定，测序正确的即为普通小麦基因TaSPX3编码序列的克隆。

【技术特征摘要】
1.一种普通小麦基因TaSPX3编码序列的克隆，其特征在于，所述小麦基因TaSPX3编码序列的克隆是按照以下方法获得的：(1)提取小麦总RNA，并合成小麦cDNA；(2)以小麦cDNA为模板PCR扩增基因TaSPX3全长cDNA，其中，PCR扩增所用引物序列如下：TaSPX3上游引物：5’-GCTCTAGAATGAAGTTTGGGAAGAGGCTCAAG-3’；TaSPX3下游引物：5’-GGGTCGACTCAAACCACCCGGACAATACC-3’；(3)回收并纯化(2)的扩增产物中目的片段并测序鉴定，测序正确的即为普通小麦基因TaSPX3编码序列的克隆。2.根据权利要求1所述的小麦基因TaSPX3编码序列的克隆在研究植物耐低磷机制和遗传改良中的应用。3.根据权利要求2所述的小麦基因TaSPX3编码序列的克隆在研究植物体耐低磷机制和遗传改良中的应用，其特征在于，先构建出改进的重组植物表达载体，重组植物表达载体上连接有小麦基因TaSPX3编码序列的克隆和GFP基因，然后将所述重组表达载体转化入植物体内，得到转化植株，利用转化植株研究小麦基因TaSPX3在植物耐低磷机制和遗传改良中的应用。4.根据权利要求3所述的小麦基因TaSPX3编码序列的克隆在研究植物体耐低磷机制和遗传改良中的应用，其特征在于，具体步骤如下：...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘娜，郑文明，商文艳，林德立，尚文静，贾利华，李闯，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：河南,41