一种DNA模板快速制备方法技术

技术编号:19448140 阅读:216 留言:0更新日期:2018-11-14 17:10
本发明专利技术公开了一种DNA模板快速制备方法,包括:在样品分散液中加入KOH溶液,将混合溶液进行沸水浴处理,然后进行离心处理,去除上层清液,将沉淀物溶解,得到DNA模板溶液;或者在样品分散液中加入KOH溶液,将混合溶液进行沸水浴处理,加入Tris‑HCl溶液和醇类,然后进行离心处理,去除上层清液,将沉淀物溶解,得到DNA模板溶液。本发明专利技术提供的这种DNA模板快速制备方法,通过在样品分散液中加入的KOH溶液,实现了同时裂解细胞和沉淀出含DNA物质的双重作用,省去了传统技术中使用低级醇(甲醇、乙醇或丙醇等)或高浓度的盐,DNA的制备温度为100℃(沸水浴),最终使DNA制备效果更好,本发明专利技术工艺简单,成本低,制备全程只需20min左右,适用范围广。

【技术实现步骤摘要】
一种DNA模板快速制备方法
本专利技术属于生物
,具体涉及一种DNA模板快速制备方法。
技术介绍
聚合酶链式反应(PCR)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术,它可看作是生物体外的特殊DNA复制,PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加,在涉及PCR反应的任何领域包括医学检验、进出口检疫检验、生命及农业科学相关研究等都需要制备用于PCR反应的DNA模板,而其限制步骤主要在DNA模板的制备。目前,常见的快速制备DNA模板的方法有氢氧化钠溶液水煮法、SDS裂解快速制备法。氢氧化钠水煮法一般用氢氧化钠溶液在较高温水浴中处理后,要么直接加较高浓度的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)来中和碱性处理液后,不经过DNA沉淀直接用于PCR;要么用Tris-HCl缓冲液中和碱性后再加乙醇离心沉淀DNA,再用TE溶解后再用于PCR。氢氧化钠水煮法的缺点:氢氧化钠溶液水煮处理再直接加TE溶液中和碱性后用于PCR,则因为DNA溶液中盐分过多(特别是当碱溶液浓度较高时,需要更高浓度的缓冲液来中和,盐分浓度则更高),影响PCR结果甚至导致无法扩增出片段;即使再加上一个步骤,即用TE溶液中和碱性后再用乙醇或异丙醇沉淀,这样对PCR影响会小一些,但是原本氢氧化钠水煮后醇沉淀DNA的效果并不理想,因此该方法的适用性并不广,针对一些生物样品有用而对另一些样品没用。SDS裂解快速提取法则用含有SDS的裂解液,在高温水浴中处理样品细胞,经过乙醇或异丙醇沉淀离心DNA把SDS等对PCR有害的成分去除后,再用TE溶解后用于PCR。SDS裂解快速制备法的缺点:由于SDS(或者其他表面活性剂)溶液加热虽然对细胞脂双层结构有破坏作用,但对细胞壁较厚的样品细胞裂解效果差,难以真正破坏细胞壁,因此SDS裂解法适用范围更窄;另外,SDS是蛋白质变性剂,其残留对后续PCR影响显著(SDS使DNA聚合酶变性失活);而且用TE作为DNA保存缓冲液有其一定的弊端,由于TE缓冲液中使用EDTA作为二价离子螯合剂为保证保存过程避免DNA水解酶降解DNA,但后续用于PCR时EDTA成分会鳌合PCR反应体系中的Mg2+离子,降低了DNA聚合酶活性(Mg2+离子是DNA聚合酶活性中心离子)。在与生命科学相关的各个领域都非常需要DNA模板快速制备技术,尽管目前有很多方法可用于DNA提取制备,但是效果比较好的方法往往耗时较长、费用相对高,而简单快速的方法又往往适用范围很窄。因此亟须发展一种耗时短、成本低和适用范围广的DNA模板制备技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种耗时短、成本低和适用范围广的DNA模板快速制备方法。本专利技术提供的这种DNA模板快速制备方法,包括:在样品分散液中加入KOH溶液,得到混合溶液;将混合溶液进行沸水浴处理,然后进行离心处理,去除上层清液,将沉淀物溶解,得到DNA模板溶液;或者在样品分散液中加入KOH溶液,得到混合溶液;将混合溶液进行沸水浴处理,加入Tris-HCl溶液和醇类,然后进行离心处理,去除上层清液,将沉淀物溶解,得到DNA模板溶液。优选的,所述混合溶液中KOH的浓度为0.05~0.5M。更优选的,所述混合溶液中KOH的浓度为0.1M。优选的,所述醇类优选为异丙醇。优选的,所述样品分散液为细胞培养液或把非液体样品分散在无菌水中。优选的,所述沸水浴处理时间为5~30min。更优选的,所述沸水浴处理时间为10~20min,水浴时间太短不能去除细胞壁和裂解细胞,导致DNA释放不充分,沸水浴时间过长会增加DNA在碱液中的水解量。优选的,所述Tris-HCl溶液加入到混合液中后的终浓度为0.1M~1M,醇类加入到混合液中后的最终体积浓度为30~60%,加入Tris-HCl溶液和醇类后混合溶液的pH为7.0~9.5。优选的,所述离心处理通过离心机沉淀。优选的,所述离心处理的离心力为13000~18000×g,离心时间为2~20min。更优选的,所述离心处理的离心力为16000×g,离心时间为10min。优选的,所述DNA模板溶液可直接用于PCR反应或置于-20℃备用。本专利技术的原理:本专利技术提供的这种DNA模板快速制备方法,通过在样品分散液中加入KOH溶液后的KOH终浓度达到0.05~0.5M,该浓度范围的KOH和加热处理能破坏细胞壁并释放DNA,然后通过离心处理就可以得到含有DNA物质的沉淀物,或者加入Tris-HCl溶液和异丙醇后再进行离心处理,得到的沉淀物中含有DNA就更高,离心后去除上清液可将多余的KOH成分去除,DNA沉淀中残余的少许KOH在加入无菌水溶解沉淀物时可以使溶液呈碱性(pH范围在7.5-9.0),以保证的DNA的稳定性,残余的KOH在最终的DNA溶液中浓度较低,作为PCR反应体系模板时用量又很少,很容易被PCR反应体系中的Tris-HCl缓冲液中和;同时由于PCR反应缓冲液中往往有KCl成分,而DNA溶液中的KOH被中和后也是钾盐,不会影响PCR。与现有技术相比,本专利技术的有益技术效果:本专利技术提供的这种DNA模板快速制备方法,通过在样品分散液中加入的KOH溶液,加热处理和离心后实现了细胞裂解和沉淀出含有DNA物质的双重作用,省去了传统技术中使用低级醇(甲醇、乙醇或丙醇等)或高浓度的盐沉淀DNA的步骤,DNA的制备温度为100℃(沸水浴),最终使DNA制备效果更好,或者在加热处理后进一步加入Tris-HCl缓冲液和醇再离心,可以得到的含更高浓度DNA的沉淀物,本专利技术工艺简单,耗时短,成本低,制备全程只需20min左右(而试剂盒需要2h左右),可适用于细菌、真菌、动物细胞、植物细胞等,相对目前公开的其他DNA快速制备方法应用更广。附图说明图1为对比例1~5和本专利技术PBC法这六种方法分别制备15种微生物DNA模板的PCR产物的凝胶电泳检测结果对比图。图2为KOH、NaOH和LiOH三种碱液对DNA模板制备的效果图。图3为不同KOH浓度对DNA模板制备的效果图。图4为采用本专利技术PBC法和EtNa法对于S.cerevisiae和M.antarcticus不同浓度菌液的DNA模板的PCR产物的凝胶电泳检测结果对比图。图5为采用本专利技术PBC法、Kits法和EtNa法对于S.cerevisiae和M.antarcticus长片段的扩增效果对比图。图6为采用EtNa法、PBC法和PBC+NP法对S.cerevisiae、A.niger、Al.alternata、M.antarcticus、Pi.Pastoris(PichiaPastoris)和Ps.Syringae(PseudomonasSyringae)这6种菌进行DNA模板制备方法的对比图。具体实施方式为了使本
的人员更好地理解本专利技术的技术方案,下面结合实施例和附图对本专利技术做进一步说明。本专利技术具体实施方式中采用了15种微生物作为处理对象,来验证本专利技术DNA模板快速制备方法的适用性,并与现有的DNA试剂盒提取法(Kits法)、EtNa法、NaOH/T法、TE/SDS法和“Water”水处理法等做了对比试验,具体所用生物材料如表1。表1实施例使用的生物材料对比例1DNA试剂盒提取法(下文简称Kits):细菌(Escherichiacoli和Bacillusthuri本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种DNA模板快速制备方法,其特征在于包括:在样品分散液中加入KOH溶液,得到混合溶液;将混合溶液进行沸水浴处理,然后进行离心处理,去除上层清液,将沉淀物溶解,得到DNA模板溶液;或者在样品分散液中加入KOH溶液,得到混合溶液;将混合溶液进行沸水浴处理,加入Tris‑HCl溶液和醇类,然后进行离心处理,去除上层清液,将沉淀物溶解,得到DNA模板溶液。

【技术特征摘要】
1.一种DNA模板快速制备方法,其特征在于包括:在样品分散液中加入KOH溶液,得到混合溶液;将混合溶液进行沸水浴处理,然后进行离心处理,去除上层清液,将沉淀物溶解,得到DNA模板溶液;或者在样品分散液中加入KOH溶液,得到混合溶液;将混合溶液进行沸水浴处理,加入Tris-HCl溶液和醇类,然后进行离心处理,去除上层清液,将沉淀物溶解,得到DNA模板溶液。2.根据权利要求1所述的DNA模板快速制备方法,其特征在于,所述混合溶液中KOH的浓度为0.05~0.5M。3.根据权利要求1所述的DNA模板快速制备方法,其特征在于,所述醇类优选为异丙醇。4.根据权利要求1所述的DNA模板快速制备方法,其特征在于,所述样品分散液为细胞培养液或把非液体样品分散在无菌水中。5.根据权利要求1所述的DNA模板快速制备方法,其特征在于,所述沸水浴处理...

【专利技术属性】
技术研发人员:李智敏严准刘云云余永廷曾粮斌高春生陈佳程毅郭利桃孙向平
申请(专利权)人:中国农业科学院麻类研究所
类型:发明
国别省市:湖南,43

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