一种催化制备UDP-鼠李糖的融合酶及其应用制造技术

一种催化制备UDP‑鼠李糖的融合酶及其应用，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。本发明专利技术获得了一种能实现辅酶自循环而催化UDP‑葡萄糖生成UDP‑鼠李糖的融合酶VvRHM‑NRS，在反应体系中只需在起始阶段添加少量的NAD

【技术实现步骤摘要】
一种催化制备UDP-鼠李糖的融合酶及其应用
本专利技术属于酶工程
，具体涉及一种融合酶的构建及其在催化制备UDP-鼠李糖中的应用。
技术介绍
L-鼠李糖是一种6-脱氧几糖，广泛存在于糖蛋白、多糖及次级代谢产物中，并发挥重要的生理活性。糖基化合物的生物合成主要是由各种不同糖基转移酶参与催化。这些酶选择性地转移特异性核苷二磷酸糖的单糖残基合成各种糖基化产物。但真核生物糖基转移酶催化底物仅限于有限几种核苷二磷酸糖，其中尿苷二磷酸糖基就是最重要的生物合成糖甙、寡糖、多糖和糖蛋白等含糖基化合物的糖基供体之一。UDP-鼠李糖在结构上是由一分子鼠李糖和一分子尿苷二磷酸所组成，是构建鼠李糖基衍生物的重要中间体，因此如何高效合成UDP-鼠李糖一直受到研究人员的关注。利用化学合成法获得UDP-鼠李糖存在得率低、反应专一性差、副产物多等缺点，而生物酶法能很好弥补化学合成的不足。在植物体内，UDP-鼠李糖合成酶(UDP-rhamnosesynthase)通过连续的三步反应催化UDP-葡萄糖生成UDP-鼠李糖。第一步反应是UDP-葡萄糖生成UDP-4-keto-6-deoxy-glucose，同时消耗NAD+生成NADH；第二步反应是UDP-4-keto-6-deoxy-glucose生成UDP-keto-rhamnose；第三步反应是UDP-keto-rhamnose被催化生成UDP-鼠李糖，同时消耗NADPH生成NADP+。由此可见虽然可以在体外利用UDP-鼠李糖合成酶催化UDP-葡萄糖合成UDP-鼠李糖，但必须在反应体系中添加至少与产物量相等的两种辅酶NAD+和NADPH，而NADPH辅酶的价格昂贵，因此该催化体系成本过高(专利申请号：CN201710230581.1；TheJournalofBiologicalChmeistry2007,282(8),5389-5403)。另一种方法是在体外催化系统中分别构建NAD+/NADH及NADP+/NADPH的循环体系，但另外构建两个辅酶的循环体系所需要的酶种类繁多，使得反应体系不具有可行性。因此，比较可行的方法是获得一种UDP-鼠李糖合成酶，该酶可实现辅酶自循环，即第三步反应能利用NADH为辅酶生成NAD+，这样就可与第一步反应组成辅酶自循环系统，彻底解决UDP-鼠李糖合成过程中的辅酶供应问题。
技术实现思路
解决的技术问题：本专利技术提供了一种催化制备UDP-鼠李糖的融合酶及其应用，利用蔗糖、UDP及NAD+制备UDP-鼠李糖。技术方案：一种催化制备UDP-鼠李糖的融合酶，氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。编码所述融合酶的基因，核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。含有所述核苷酸序列的重组质粒。含有所述重组质粒的大肠杆菌。所述的融合酶与蔗糖合成酶组成双酶催化体系在制备UDP-鼠李糖中的应用。上述应用的反应体系为50mMpH8.0的磷酸缓冲液，300mM蔗糖，8mMUDP，1mMNAD+，1mMDTT和0.16mg/mL融合酶及0.02mg/mL蔗糖合成酶，30℃反应48小时，能获得0.57mM的UDP-鼠李糖。有益效果：1.获得了一种能实现辅酶自循环而催化UDP-葡萄糖生成UDP-鼠李糖的融合酶VvRHM-NRS，在反应体系中只需在起始阶段添加少量的NAD+，无需加入NADPH，就可生成UDP-鼠李糖，这是首次报道能实现辅酶自循环而合成UDP-鼠李糖；2.利用VvRHM-NRS和GmSUS组成双酶催化体系，该催化体系首次实现了利用蔗糖、UDP及NAD+制备UDP-鼠李糖，无需添加昂贵的底物UDP-葡萄糖，而实现UDP-鼠李糖的制备，可以大幅降低制备成本。附图说明图1VvRHM-NRS和GmSUS双酶催化体系制备UDP-鼠李糖示意图；图2温度及pH对VvRHM活性的影响，(a)温度对酶活的影响，(b)pH对酶活的影响，(c)温度稳定性。图3NRS/ER对VvRHM催化UDP-葡萄糖生成UDP-鼠李糖的影响，(a)不同条件下生成UDP-鼠李糖的示意图，(b)HPLC检测生成的UDP-鼠李糖，(c)ESI-MS检测生成的UDP-鼠李糖。图4温度及pH对融合酶VvRHM-NRS活性的影响，(a)温度对酶活的影响，(b)pH对酶活的影响，(c)温度稳定性。图5反应条件对VvRHM-NRS和GmSUS双酶催化体系制备UDP-鼠李糖的影响，(a)UDP对双酶催化体系制备UDP-鼠李糖的影响，(b)NAD+对双酶催化体系制备UDP-鼠李糖的影响，(c)VvRHM-NRS和GmSUS双酶催化体系制备UDP-鼠李糖的时间曲线。具体实施方式以下实施例只为说明本专利技术的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本专利技术的内容并据以实施，并不能以此限制本专利技术的保护范围。凡根据本专利技术精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本专利技术的保护范围之内。为了进一步理解本专利技术，下面结合实施例对本专利技术进行详细阐述，其中，如无特殊说明，实施例中涉及的各种反应试剂均可以通过商业渠道购买得到；如无特殊说明，实施例中涉及的具体操作参见《分子克隆实验指南第三版》。本专利技术利用来源于Vitisvinifera的UDP-鼠李糖合成酶VvRHM和来源于Arabidopsisthaliana的双功能酶UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose3,5-epimerase/UDP-4-keto-rhamnose4-keto-reductase(NRS/ER)构建一种融合酶VvRHM-NRS。该融合酶VvRHM-NRS催化第三步反应生成UDP-鼠李糖时能利用辅酶NADH，而无需消耗NADPH，因此该融合酶进行催化反应时能实现辅酶自循环，仅需在反应开始阶段添加少量的NAD+，就能实现催化UDP-葡萄糖生成UDP-鼠李糖。随后通过与Glycinemax来源的蔗糖合成酶GmSUS组成双酶催化体系能利用蔗糖、UDP及NAD+制备UDP-鼠李糖(图1)。该体系可用于生产制备各种鼠李糖基衍生物，具有很好的应用前景。实施例11.Vitisvinifera来源的UDP-鼠李糖合成酶VvRHM的克隆、表达及定性1.1VvRHM基因的优化合成及重组质粒构建对Vitisvinifera来源的UDP-鼠李糖合成酶VvRHM基因(XP_002285634.1)按照大肠杆菌K12优势密码子表(http://www.kazusa.or.jp/codon/)对上述基因序列进行优化，选择氨基酸同义密码子使用频率高的密码子作为优势密码子，最终获得优化后的酶基因序列信息，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，并在基因的N端和C端分别添加NcoI和BamHI酶切位点，并在其C端融合6个组氨酸标签，获得优化后的VvRHM基因，其核酸序列分别为SEQIDNO:1所示。将优化后的VvRHM基因用NcoI和BamHI双酶切，同时将重组质粒pCDFDuet-1也用NcoI和BamHI双酶切，并分别割胶回收，浓缩后16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得重组质粒pCDFDuet-VvRHM。1.2VvRHM的重组表达、纯化及定性1.2.1VvRHM的重组表达、纯化将重组质粒pCDFDuet本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种催化制备UDP‑鼠李糖的融合酶，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。

【技术特征摘要】
1.一种催化制备UDP-鼠李糖的融合酶，其特征在于氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。2.编码权利要求1所述融合酶的基因，其特征在于核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。3.含有权利要求2所述核苷酸序列的重组质粒。4.含有权利要求3所述重组质粒的大肠杆菌。5.权利要求1所述的融合酶与蔗糖合成酶组成...

【专利技术属性】
技术研发人员：裴建军，赵林果，陈安娜，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32