本发明专利技术提供一种外切型硫酸软骨素酶ABC，其DNA序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术还提供一种外切型硫酸软骨素酶ABC融合蛋白，该融合蛋白融合有上述外切型硫酸软骨素酶ABC和纯化标签。同时，本发明专利技术还提供一种含有上述外切型硫酸软骨素酶ABC的重组载体和转化体。本发明专利技术提供的外切型硫酸软骨素酶ABC的DNA序列对大肠杆菌的偏好性达0.97，从而提高了硫酸软骨素酶ABC的DNA序列在大肠杆菌中的表达效率，进而直接降低了外切型硫酸软骨素酶ABC的生产成本。另外，本发明专利技术还提供一种上述外切型硫酸软骨素酶ABC的制备方法和应用。
【技术实现步骤摘要】
一种外切型硫酸软骨素酶ABC及其制备方法与应用
本专利技术属于生物制药领域，具体地，涉及一种外切型硫酸软骨素酶ABC及其制备方法与应用。
技术介绍
硫酸软骨素酶(chondroitinase或chondroitinsulfateyase，简称为“ChSase”)是一类能将硫酸软骨素、软骨素、透明质酸等糖胺聚糖降解为不饱和二糖(ΔDi及寡糖)的裂解酶。根据其作用底物的差异主要分为ChSaseABC、ChSaseAC、ChSaseB及ChSaseC等类型。目前，ChSaseABC为特异性最为广泛的一类硫酸软骨素裂解酶。近几年，国际上对ChSaseABC的关注越来越多，相关学术论文的数量迅速增长。而且研究表明ChSaseABC有多种重要用途，在基础研究中它用来构建二糖和寡糖的基因文库；研究糖胺多糖结构和性质；在临床领域，用来治疗一些疾病。另外有两项新增应用非常重要：一是作为（chondroitinsulfate,简称为“CS”）的检测试剂，2010版药典规定CS原料药进行含量测定时需要进行如下操作：用ChSaseABC酶解待检测CS，测定双糖总含量。二是在酶法生产低分子量CS中作为催化剂应用。大量研究发现，当将CS的分子量降低至2～10kD时，其药效更为明显，对防止动脉粥样硬化、风湿性炎症和伤口愈合有更好的疗效。目前对低分子量CS的制备常采用酸水解法、离子交换法和酶解法。比较而言，酶解法需要的条件不高且容易控制，因而具备较大的优势。酶解法的关键在于获得大量、廉价的硫酸软骨素裂解酶。因此，ChSaseABC具有生物学作用，应用前景广阔。然而，目前国内没有产品供应，全部依靠进口，而且由于当前酶的提取效率、重组表达效率及亲和纯化能力普遍较低，使其在国际市场的价格居高不下。较低的生产能力和过高的价格是制约其功能研究和应用开发的重要因素。所以，开发ChSaseABC的新型高效表达和纯化技术具有极其重要的研究价值，其成功研制对提升我国ChSaseABC生物表达的技术水平及拓展其应用领域具有重要的科学意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供一种外切型硫酸软骨素酶ABC及其制备方法与应用，以解决上述问题。具体地，本专利技术采取如下技术方案：一种外切型硫酸软骨素酶ABC，它的DNA序列如SEQIDNO.1所示。一种外切型硫酸软骨素酶ABC融合蛋白，它融合有外切型硫酸软骨素酶ABC和纯化标签，其中，所述外切型硫酸软骨素酶ABC的DNA序列如SEQIDNO.1所示，所述纯化标签为His标签、MBP标签或GST标签。基于上述，所述外切型硫酸软骨素酶ABC融合蛋白的分子量为114～154.8kDa。基于上述，以硫酸软骨素A及硫酸软骨素C的混合物为底物时，所述外切型硫酸软骨素酶ABC融合蛋白的酶活为1553～5968IU/L发酵液。一种重组载体，它包括载体和与所述载体连接的上述的外切型硫酸软骨素酶ABC融合蛋白，其中，所述载体为pET-28a、PMAL-C2X或pGEX-4T1。一种转化体，它是将上述的重组载体转化到宿主细胞中进行表达而得到的，其中，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21、大肠杆菌BL21(DE3)或大肠杆菌Trans109。本专利技术还提供一种外切型硫酸软骨素酶ABC的制备方法，其步骤包括：从普通变形杆菌中获取硫酸软骨素酶ABC的原始DNA序列；对所述原始DNA序列进行密码子优化，得到如SEQIDNO.1所示的DNA序列；扩增如SEQIDNO.1所示的DNA序列，并和载体进行重组构建，得到重组载体；将所述重组载体转化至大肠杆菌表达，获得转化体；培养所述转化体，并进行物理破碎处理，得到所述外切型硫酸软骨素酶ABC。基于上述，所述培养所述转化体的步骤包括：采用LB培养基在37℃培养所述转化体1～3h，加入终浓度为0.3～0.6mM的IPTG诱导，然后在16℃～20℃培养18～24h。本专利技术还提供一种外切型硫酸软骨素酶ABC的应用，其包括采用外切型硫酸软骨素酶AC对类肝素原料中硫酸软骨素进行降解的步骤，其中，所述外切型硫酸软骨素酶AC的DNA序列如SEQIDNO.1所示。基于上述，它包括：以水为缓冲溶液，在温度为32～42℃、pH值为7.5～8.5的条件下，采用所述外切型硫酸软骨素酶ABC对类肝素原料中硫酸软骨素进行降解。与现有技术相比，本专利技术具有突出的实质性特点和显著进步。具体的说，本专利技术提供的外切型硫酸软骨素酶ABC的DNA序列如SEQIDNO.1所示，该DNA序列在大肠杆菌主中的密码子适应性增大至0.97并且其偏好密码子的频率显著提高，从而提高了外切型硫酸软骨素酶ABC的DNA序列在大肠杆菌中的表达效率；当以硫酸软骨素A及硫酸软骨素C的混合物为底物时，所述外切型硫酸软骨素酶ABC的酶活为1553～5968IU/L发酵液，因此，本专利技术提供的外切型硫酸软骨素酶ABC生产成本比较低，有利于外切型硫酸软骨素酶ABC的推广应用。本专利技术提供一种所述外切型硫酸软骨素酶ABC的制备方法，该制备方法主要是通过从普通变形杆菌中获取外切型硫酸软骨素酶ABC的原始DNA序列，并对该原始DNA序列进行密码子优化，针对常用酶切位点pstI进行了优化，避免了3个polyA（AAAAAAA）结构，2个poly（TTTTTT）结构，以及对2136处的重组序列，使得由该方法得到的如SEQIDNO.1所示的外切型硫酸软骨素酶ABC的DNA序列在大肠杆菌主中的密码子适应性增大至0.97并且其偏好密码子的频率显著提高，从而提高了外切型硫酸软骨素酶ABC在大肠杆菌中的表达效率，而且该方法比较简单，成本比较低。同时，本专利技术还提供该外切型硫酸软骨素酶ABC的应用，采用外切型硫酸软骨素酶ABC对类肝素原料中硫酸软骨素和硫酸皮肤素进行降解的步骤，该外切型硫酸软骨素酶ABC具有高选择性，可以充分分解类肝素原料中硫酸软骨素和硫酸皮肤素而留下肝素和硫酸乙酰肝素重新利用；进一步，所述外切型硫酸软骨素酶ABC具有较强的稳定性，可以以水为缓冲溶液对硫酸软骨素进行降解，避免采用Tris或其他盐类缓冲溶液对肝素造成污染，增加分离步骤。本专利技术提供的外切型硫酸软骨素酶ABC有一定的耐酒精性。附图说明图1为本专利技术实施例提供的外切型硫酸软骨素酶ABC的DNA序列的密码子适应性指标图。图2为本专利技术实施例提供的外切型硫酸软骨素酶ABC的DNA序列的高频密码子分布图。图3为本专利技术实施例使用的硫酸软骨素酶ABC的原始DNA序列的密码子适应性指标图。图4为本专利技术实施例使用的硫酸软骨素酶ABC的原始DNA序列的高频密码子分布图。图5为本专利技术实施例中外切型硫酸软骨素酶ABC的电泳图，其中：从左至右泳道1为BlueplusIVmarker；泳道2为pet28a-His-chABCIIBl21(de3)全细胞；泳道3为全细胞破碎后上清液；泳道4为全细胞破碎后沉淀；泳道5为纯化后外切型硫酸软骨素酶ABC。图6是肝素酶I降解HP的HPLC图谱。图7是肝素酶III降解HS的HPLC图谱。图8是外切型硫酸软骨素酶ABC降解HP的HPLC图谱。图9是外切型硫酸软骨素酶ABC降解HS的HPLC图谱。图10是外切型硫酸软骨素酶ABC降解CS的HPLC图谱。图11是外切型硫酸软骨素酶ABC降解DS的HPLC图谱。序列表中：SEQID本文档来自技高网...
【技术保护点】
1. 一种外切型硫酸软骨素酶ABC，其特征在于，它的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种外切型硫酸软骨素酶ABC，其特征在于，它的DNA序列如SEQIDNO.1所示。2.一种外切型硫酸软骨素酶ABC融合蛋白，它融合有外切型硫酸软骨素酶ABC和纯化标签，其特征在于，所述外切型硫酸软骨素酶ABC的DNA序列如SEQIDNO.1所示，所述纯化标签为His标签、MBP标签或GST标签。3.根据权利要求2所述的外切型硫酸软骨素酶ABC融合蛋白，其特征在于，它的分子量为114～154.8kDa。4.根据权利要求2所述的外切型硫酸软骨素酶ABC，其特征在于，以硫酸软骨素A及硫酸软骨素C的混合物为底物时，所述外切型硫酸软骨素酶ABC融合蛋白的酶活为1553～5968IU/L发酵液。5.一种重组载体，其特征在于，它包括载体和与所述载体连接的权利要求2或3或4所述的外切型硫酸软骨素酶ABC融合蛋白，其中，所述载体为pET-28a、PMAL-C2X或pGEX-4T1。6.一种转化体，其特征在于，它是将权利要求5所述的重组载体转化到宿主细胞中进行表达而得到的，其中，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21、大肠杆菌BL21(DE3)或大肠杆菌Trans109。7.一种外切型硫酸软骨素...
【专利技术属性】
技术研发人员：李晔，周朝，兰蓉，辛秀兰，袁其朋，
申请(专利权)人：北京电子科技职业学院，
类型：发明
国别省市：北京,11
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