一种外切型硫酸软骨素酶AC及其制备方法与应用技术

本发明专利技术提供一种外切型ChSase AC，其DNA序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术还提供一种外切型ChSase AC融合蛋白，该融合蛋白融合有上述外切型ChSase AC和纯化标签。本发明专利技术还提供一种含有上述外切型ChSase AC的重组载体和转化体。本发明专利技术提供的外切型ChSase AC的DNA序列对大肠杆菌的偏好性达到90%以上，从而提高了ChSase AC的DNA序列在大肠杆菌中的表达效率，进而直接降低了ChSase AC的生产成本，有利于ChSase AC的推广应用。另外，本发明专利技术还提供一种上述外切型ChSase AC的制备方法和应用。上述外切型ChSase AC可以去除类肝素原料中的硫酸软骨素。

【技术实现步骤摘要】
一种外切型硫酸软骨素酶AC及其制备方法与应用
本专利技术属于生物制药领域，具体地，涉及一种外切型硫酸软骨素酶AC及其制备方法与应用。
技术介绍
硫酸软骨素酶(chondroitinase或chondroitinsulfateyase，简称为“ChSase”)是一类能将硫酸软骨素、软骨素、透明质酸等糖胺聚糖降解为不饱和二糖(ΔDi及寡糖)的裂解酶。根据其作用底物的差异主要分为ChSaseABC、ChSaseAC、ChSaseB及ChSaseC等类型。虽然ChSaseABC为特异性最为广泛的一类硫酸软骨素裂解酶，理论上可以对各种类型的硫酸软骨进行切割，但是随后的研究发现，ChSaseABC发挥作用的效果与底物种类的复杂程度有密切关系，当底物中硫酸软骨素的种类越多，ChSaseABC表现出的综合活性越低。所以，其它类型的ChSaseAC、ChSaseB及ChSaseC也是人们研究的重点。比如，目前国际上对ChSaseAC的关注越来越多，而且研究显示ChSaseAC有多种重要用途，在基础研究中它用来构建二糖和寡糖的基因文库；研究糖胺多糖结构和性质；在临床领域，用来治疗一些疾病。另外有两项新增应用非常重要：1）在酶法生产低分子量硫酸软骨素CS中作为催化剂应用；2）在类肝素酶法精制中的应用。以上所有ChSaseAC推广及应用关键在于获得大量、廉价的硫酸软骨素酶。目前ChSaseAC获取的途径是通过Arthrobacteraurescens发酵提纯获得，但是存在Arthrobacteraurescens菌生长缓慢、ChSaseAC表达水平低以及分离纯化复杂等问题，从而直接增加了硫酸软骨素酶的生产成本，较低的生产能力和过高的价格是制约其功能研究和应用开发的重要因素。所以，开发ChSaseAC的新型高效表达和纯化技术具有极其重要的研究价值，其成功研制对提升我国ChSaseAC生物表达的技术水平及拓展其应用领域具有重要的科学意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供一种外切型ChSaseAC及其制备方法与应用，以解决上述问题。具体地，本专利技术采取如下技术方案：一种外切型ChSaseAC，它的DNA序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术提供一种外切型ChSaseAC融合蛋白，它融合有具有外切型ChSaseAC和纯化标签，其中，所述外切型ChSaseAC的DNA序列如SEQIDNO.1所示，所述纯化标签为His标签、MBP标签或GST标签。基于上述，所述外切型ChSaseAC融合蛋白的分子量为79～122kDa。基于上述，当底物为硫酸软骨素A时，所述外切型ChSaseAC融合蛋白的酶活性为80～9500IU/L发酵液。本专利技术还提供一种重组载体，它包括载体和与所述载体连接的上述外切型ChSaseAC融合蛋白，其中，所述载体为PMAL-C2X、pGEX-4T1或pET-15d。本专利技术还提供一种转化体，它是将上述重组载体转化到宿主细胞中进行表达而得到的，其中，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21、大肠杆菌BL21(DE3)或大肠杆菌Trans109。本专利技术还提供一种外切型ChSaseAC的制备方法，其步骤包括：从黄金节杆菌中获取外切型ChSaseAC的源DNA序列；对所述源DNA序列进行密码子优化，得到如SEQIDNO.1所示的DNA序列；扩增如SEQIDNO.1所示的DNA序列，并和载体进行基因重组构建，得到重组载体；将所述重组载体转化至大肠杆菌表达，获得转化体；培养所述转化体，并进行物理破碎处理，得到所述外切型ChSaseAC。基于上述，所述培养所述转化体的步骤包括：采用LB培养基在37℃培养所述转化体2～4h，加入终浓度为0.25～0.5mM的IPTG诱导，然后在16℃～42℃培养18～24h。本专利技术还提供一种上述外切型ChSaseAC的应用方法，其包括采用外切型ChSaseAC对类肝素原料中硫酸软骨素进行降解的步骤，其中，所述外切型ChSaseAC的DNA序列如SEQIDNO.1所示。基于上述，它包括：以水为缓冲溶液，在室温下和pH值为5.9～6.5的条件下，采用所述外切型ChSaseAC对类肝素原料中硫酸软骨素进行降解。与现有技术相比，本专利技术具有突出的实质性特点和显著进步。具体的说，本专利技术提供的外切型ChSaseAC的DNA序列如SEQIDNO.1所示，该DNA序列是一种全新的硫酸软骨素酶AC编码基因，该DNA序列的多个等位点避开了polyA结构（AAAA），而且还避开不稳定的mRNA结构序列(ATTTA)，所以，所述DNA序列在大肠杆菌主中的密码子适应性增大到90%以上且其偏好密码子的频率显著提高，从而提高了ChSaseAC的DNA序列在大肠杆菌中的表达效率；当底物为硫酸软骨素A时，所述外切型ChSaseAC的酶活性可以达到80～9500IU/L发酵液，因此，本专利技术提供的外切型ChSaseAC可以直接降低了ChSaseAC的生产成本，有利于ChSaseAC的推广应用。本专利技术提供一种所述外切型ChSaseAC的制备方法，该制备方法主要是通过从黄金节杆菌中获取外切型ChSaseAC的源DNA序列，并对该源DNA序列进行密码子优化，等到一种全新的、与源DNA序列完全不同的、如SEQIDNO.1所示的DNA序列，该全新的DNA序列避免了所述源DNA序列中的203-207bp、260-264bp、764-769bp、956-960bp、1989-1993bp和2244-2248bp等位点的polyA结构（AAAA），而且还避免了处于764-769bp位点的不稳定的mRNA结构序列(ATTTA)，使得本专利技术得到如SEQIDNO.1所示的外切型ChSaseAC的DNA序列提高了其在大肠杆菌中的表达效率，而且该方法比较简单，成本比较低。另外，本专利技术还提供该外切型ChSaseAC的应用方法，采用外切型ChSaseAC对类肝素原料中硫酸软骨素进行降解的步骤，该外切型ChSaseAC具有高选择性，可以充分分解类肝素原料中硫酸软骨素而留下肝素和硫酸乙酰肝素重新利用；进一步，所述外切型ChSaseAC具有较强的稳定性，可以以水为缓冲溶液对硫酸软骨素进行降解，避免采用Tris或其他盐类缓冲溶液对肝素造成污染，增加分离步骤。附图说明图1为实施例1中MBP-AachAC表达的外切型ChSaseAC的电泳图，其中，泳道1为MBP-AachACBL21全细胞；泳道2为MBP-AachAC破碎后上清液；泳道3为MBP-AachAC破碎后沉淀；泳道4为纯化后MBP-AachAC酶。图2为实施例2中His-AachAC表达的外切型ChSaseAC的电泳图，其中，泳道1为His-AachACBL21全细胞；泳道2为His-AachAC破碎后上清液；泳道3为His-AachAC破碎后沉淀；泳道4为纯化后His-AachAC酶。图3是对His-AachAC酶活性随温度变化曲线。图4是对His-AachAC酶活性随pH变化曲线。图5是His-AachAC酶的双倒数曲线1/V-1/S。图6是His-AachAC酶在不同温度下的稳定性变化。图7是三种宿主表达GST-AachAC酶的酶活性对比图。图8为实施例3中GST-AachAC表达的外切型ChSaseAC的电泳图，其中，泳本文档来自技高网...

【技术保护点】
1. 一种外切型硫酸软骨素酶AC，其特征在于，它的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种外切型硫酸软骨素酶AC，其特征在于，它的DNA序列如SEQIDNO.1所示。2.一种外切型硫酸软骨素酶AC融合蛋白，它融合有外切型硫酸软骨素酶AC和纯化标签，其特征在于，所述外切型硫酸软骨素酶AC的DNA序列如SEQIDNO.1所示，所述纯化标签为His标签、MBP标签或GST标签。3.根据权利要求2所述的外切型硫酸软骨素酶AC融合蛋白，其特征在于，它的分子量为80.6～122kDa。4.根据权利要求2所述的外切型硫酸软骨素酶AC融合蛋白，其特征在于，底物为硫酸软骨素A时，所述外切型硫酸软骨素酶AC融合蛋白的酶活性为80～9500IU/L发酵液。5.一种重组载体，其特征在于，它包括载体和与所述载体连接的权利要求2或3或4所述的外切型硫酸软骨素酶AC融合蛋白，其中，所述载体为PMAL-C2X、pGEX-4T1或pET-15d。6.一种转化体，其特征在于，它是将权利要求5所述的重组载体转化到宿主细胞中进行表达而得到的，其中，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21、大肠杆菌BL21(DE3)或大肠杆菌Trans109。7.一种外切型硫酸软骨素酶AC的...

【专利技术属性】
技术研发人员：李晔，周朝，李舜尧，冯晖，辛秀兰，袁其朋，
申请(专利权)人：北京电子科技职业学院，
类型：发明
国别省市：北京,11