本发明专利技术公开了一种赖氨酸脱羧酶突变体，它是由氨基酸序列如SEQ ID No:2所示的赖氨酸脱羧酶通过定点突变得到，为如下(1)和(2)中的任意一种：(1)将氨基酸序列如SEQ ID No:2所示的赖氨酸脱羧酶的第12位的缬氨酸突变为半胱氨酸，第41位的天冬氨酸突变为半胱氨酸，得到赖氨酸脱羧酶突变体V12C/D41C；(2)将氨基酸序列如SEQ ID No:2所示的赖氨酸脱羧酶的第89位的亮氨酸突变为半胱氨酸，第442位的亮氨酸突变为半胱氨酸，得到赖氨酸脱羧酶突变体L89C/L442C。本发明专利技术提供的赖氨酸脱羧酶突变体其在耐碱及催化性能方面有大幅度提高，更加适合工业化生产需求，满足社会生产的要求。
【技术实现步骤摘要】
一种赖氨酸脱羧酶突变体、其编码基因及其表达和应用
本专利技术涉及赖氨酸脱羧酶的突变，具体涉及一种赖氨酸脱羧酶突变体、其编码基因及其表达和应用。
技术介绍
尼龙(PA)，作为工程塑料中最大最重要的品种，具有很强的生命力，主要在于它改性后实现高性能化，其次是汽车、电器、通讯、电子、机械等产业自身对产品高性能的要求越来越强烈。相关产业的飞速发展，促进了全球市场对尼龙需求量的不断提高。当前，传统尼龙材料都来源于石油产品，难以做到可持续性无疑是一个明显的缺陷。出于对全球环境问题的担忧和持续增加的废弃物处理难度的考虑，生物基尼龙材料是最理想的替代性材料。1,5-戊二胺作为生物基尼龙材料的重要单体，其工业化的生物合成也是必然趋势和一个亟待解决的问题。赖氨酸脱羧酶(简称LCD)是一种生物体内高度专一性酶，能够催化赖氨酸脱去一个CO2分子，生成1,5-戊二胺的胞内酶。其来源广泛，在芽孢杆菌(Bacillus)、大肠杆菌(E.coli)、毛链霉菌(Streptomycespolosus)、峰房哈夫尼菌(Hafniaalvei)等微生物中都有发现LCD的存在。该酶需要磷酸吡哆醛(PLP)作为其辅酶，帮助其完成脱羧反应。赖氨酸脱羧酶主要分为组成型酶LdcC和诱导型酶CadA(又称LdcI)，尽管LdcC具有更为广泛的最适pH值，但是其催化活性和稳定性比较差，因此很少用于赖氨酸的脱羧反应。与此相反，CadA由于较高的表达水平及更高的催化活性，通常用于戊二胺的生产。然而，在脱羧酶反应的情况下，一分子的赖氨酸被脱羧就会消耗一个质子，戊二胺的大量积累也伴随着反应体系pH的逐渐增加，这对于CadA的酶活及稳定性来说是不利的。在大肠杆菌本体天然途径中，CadA通常由细胞生长的酸性发酵产物如乙酸等引起的细胞质pH降低而诱导表达的。因此，与其他酶相比，CadA的结构稳定性及活性对于pH的变化十分敏感。虽然目前CadA被广泛用于戊二胺的生产研究，但是克服其原有的不稳定性对于开发戊二胺的工业化生产是必不可少的。据报道，赖氨酸脱羧酶CadA本身是一个二聚体的结构，在行使功能的时候则是一个十聚体的结构，而当pH逐渐上升的时候，CadA会自动发生一个解聚的过程，变为二聚体的结构，此时，CadA的催化活性急剧下降。
技术实现思路
专利技术目的：为了解决现有的赖氨酸脱羧酶在高pH下耐受性能弱的问题，本专利技术第一方面提供了一种赖氨酸脱羧酶突变体，第二方面提供了赖氨酸脱羧酶突变体的编码基因，第三方面提供了赖氨酸脱羧酶突变体的表达及应用。技术方案：本专利技术第一专利技术提供了一种赖氨酸脱羧酶突变体，它是由氨基酸序列如SEQIDNo:2所示的赖氨酸脱羧酶通过定点突变得到，定点突变方法为如下(1)和(2)中的任意一种：(1)将氨基酸序列如SEQIDNo:2所示的赖氨酸脱羧酶的第12位的缬氨酸突变为半胱氨酸，第41位的天冬氨酸突变为半胱氨酸，得到赖氨酸脱羧酶突变体V12C/D41C；(2)将氨基酸序列如SEQIDNo:2所示的赖氨酸脱羧酶的第89位的亮氨酸突变为半胱氨酸，第442位的亮氨酸突变为半胱氨酸，得到赖氨酸脱羧酶突变体L89C/L442C。通过分析赖氨酸脱羧酶十聚体的三级结构,排除位于脱羧酶单体内的氨基酸以及保守氨基酸外，选择了两对氨基酸，将其突变为二硫键更强的半胱氨酸，以提高二硫共价键的结合力。优选地，所述赖氨酸脱羧酶突变体为赖氨酸脱羧酶突变体V12C/D41C。本专利技术第二方面提供编码赖氨酸脱羧酶突变体的CadA基因，当赖氨酸脱羧酶突变体为赖氨酸脱羧酶突变体V12C/D41C时，CadA基因的核苷酸序列如SEQIDNo:3所示，赖氨酸脱羧酶突变体V12C/D41C的氨基酸序列如SEQIDNo:4所示；当赖氨酸脱羧酶突变体为赖氨酸脱羧酶突变体L89C/L442C时，CadA基因的核苷酸序列如SEQIDNo:5所示，赖氨酸脱羧酶突变体L89C/L442C的氨基酸序列如SEQIDNo:6所示。本专利技术第三方面提供包含上述CadA基因的重组载体。优选地，所述载体为pETDuet-1，重组载体的构建方法如下：(1)构建重组质粒pETDuet-1-CadA以大肠杆菌(E.coli)MG1655基因组为模板，以cadA基因两端的引物进行PCR扩增，得到的CadA片段克隆至载体pETDuet-1的NdeI和KpnI酶切位点之间，得到重组质粒pETDuet-1-CadA。所述两端引物如下：Primer1-F:5’-GGAATTCCATATGAACGTTATTGCAATATTG-3’Primer1-R:5’-GGGGTACCTTATTTTTTGCTTTCTTCTTTC-3’；(2)构建定点突变质粒a、以步骤(1)构建的重组质粒pETDuet-1-CadA为模板，利用两轮PCR(聚合酶链式反应)体外扩增得到定点突变质粒pETDuet-1-CadA-M1(L89C/L442C)，即将第89位亮氨酸/第442位亮氨酸分别突变为半胱氨酸；用于定点突变的引物如下：L89Cprimer-F：5’-GCTAATACGTATTCCACTTGCGATGTAAGCCTGAATG-3’L89Cprimer-R：5’-CATTCAGGCTTACATCGCAAGTGGAATACGTATTAGC-3’L442Cprimer-F：5’-CGTAAAGAGATCAAACGTTGCAGAACGGAATCTGATG-3’L442Cprimer-R：5’-CATCAGATTCCGTTCTGCAACGTTTGATCTCTTTACG-3’向通过PCR扩增得到的定点突变质粒中加入DpnI，异性切除甲基化的DNA链(即模板DNA)。b、以步骤(1)构建的重组质粒pETDuet-1-CadA为模板，利用两轮PCR(聚合酶链式反应)体外扩增得到定点突变质粒pETDuet-1-CadA-M3(V12C/D41C)，即将第12位缬氨酸/第41位天冬氨酸分别突变为半胱氨酸；用于定点突变的引物如下：V12Cprimer-F：5’-TATTGAATCACATGGGGTGCTATTTTAAAGAAGAACCC-3’V12Cprimer-R：5’-TTCTTCTTTAAAATAGCACCCCATGTGATTCAATATTG-3’D41Cprimer-F：5’-CCCGAACGACCGTGACTGCTTATTAAAACTGATCG-3’D41Cprimer-R：5’-CGATCAGTTTTAATAAGCAGTCACGGTCGTTCGGG-3’。向通过PCR扩增得到的定点突变质粒中加入DpnI，异性切除甲基化的DNA链(即模板DNA)。本专利技术第四方面提供包含所述CadA基因的重组菌株。优选地，所述菌株为E.coliBL21(DE3)。本方面第五方面提供一种表达赖氨酸脱羧酶突变体的方法，包括以下步骤：(1)将含编码赖氨酸脱羧酶突变体的CadA基因的重组载体转化至E.coliBL21(DE3)中，得到重组菌株；(2)将重组菌株活化后接种于LB培养基中，当OD600达到0.6-0.8时，加入IPTG诱导表达赖氨酸脱羧酶突变体。优选地，步骤(2)中所述IPTG在LB培养基中的终浓度为0.01-1mM，所述诱导条件为18-37℃，10-12h。优选地，步骤(1)本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种赖氨酸脱羧酶突变体，其特征在于，它是由氨基酸序列如SEQ ID No:2所示的赖氨酸脱羧酶通过定点突变得到，定点突变方法为如下(1)和(2)中的任意一种：(1)将氨基酸序列如SEQ ID No:2所示的赖氨酸脱羧酶的第12位的缬氨酸突变为半胱氨酸，第41位的天冬氨酸突变为半胱氨酸，得到赖氨酸脱羧酶突变体V12C/D41C；(2)将氨基酸序列如SEQ ID No:2所示的赖氨酸脱羧酶的第89位的亮氨酸突变为半胱氨酸，第442位的亮氨酸突变为半胱氨酸，得到赖氨酸脱羧酶突变体L89C/L442C。
【技术特征摘要】
1.一种赖氨酸脱羧酶突变体，其特征在于，它是由氨基酸序列如SEQIDNo:2所示的赖氨酸脱羧酶通过定点突变得到，定点突变方法为如下(1)和(2)中的任意一种：(1)将氨基酸序列如SEQIDNo:2所示的赖氨酸脱羧酶的第12位的缬氨酸突变为半胱氨酸，第41位的天冬氨酸突变为半胱氨酸，得到赖氨酸脱羧酶突变体V12C/D41C；(2)将氨基酸序列如SEQIDNo:2所示的赖氨酸脱羧酶的第89位的亮氨酸突变为半胱氨酸，第442位的亮氨酸突变为半胱氨酸，得到赖氨酸脱羧酶突变体L89C/L442C。2.根据权利要求1所述的赖氨酸脱羧酶突变体，其特征在于，其为赖氨酸脱羧酶突变体V12C/D41C。3.编码权利要求1所述赖氨酸脱羧酶突变体的CadA基因，其特征在于，当赖氨酸脱羧酶突变体为赖氨酸脱羧酶突变体V12C/D41C时，CadA基因的核苷酸序列如SEQIDNo:3所示；当赖氨酸脱羧酶突变体为赖氨酸脱羧酶...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈可泉，王璟，许晟，毛静文，高思远，欧阳平凯，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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