一种安全高效的CRISPR/Cas9基因编辑技术制造技术

本发明专利技术针对现有CRISPR/Cas9基因编辑技术脱靶效应的技术缺陷，对Cas9蛋白的DNA序列结合的位点进行了氨基酸位点定点突变，获得了脱靶效率低的Cas9蛋白，从而实现靶向性更好更高效的基因编辑功能。同时，本发明专利技术还提供了一种采用此基因编辑方法进行HEK293T细胞基因编辑的方法。

【技术实现步骤摘要】
一种安全高效的CRISPR/Cas9基因编辑技术
本专利技术涉及基因编辑
，尤其涉及一种安全高效的CRISPR/Cas9基因编辑技术
技术介绍
规律性重复短回文序列簇/CRISPR相关基因(Clusteredregulatoryinterspacedshortpalindromicrepeat/CRISPR-associatedgenes,CRISPR/Cas)系统是细菌对噬菌体的长期抗争过程中进化产生的一种获得性免疫防御系统，普遍存在于细菌与古生菌中。CRISPR是一类独特的DNA串联重复序列，CRISPR基因座由一个前导区(Leader)、多个短而高度保守的重复序列区(Repeat)和多个间隔序列区(Spacer)组成。Cas基因一般位于CRISPR基因座附近。根据Cas基因核心元件序列的不同，CRISPR/Cas免疫系统被分为3种类型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR/Cas免疫系统需要多个Cas蛋白形成复合体切割DNA双链，而Ⅱ型CRISPR/Cas免疫系统只需要一个Cas9蛋白来切割DNA双链。Ⅱ型系统是目前被改造得最为成功的人工核酸酶，其CRISPR/Cas基因座结构包括5'端的tracrRNA(trans-activatingcrRNA)基因，tracrRNA主要与CRISPR转录产物(CRISPR-derivedRNA，crRNA)形成crRNA：tracrRNA复合体，帮助Cas9蛋白识别并与crRNA：tracrRNA复合体结合，实现靶点特异性识别；中间是一系列Cas蛋白编码基因(包括Cas9、Cas1、Cas2和Csn2)，主要发挥核酸酶切割作用；3'端是CRISPR基因座。目前，CRISPR/Cas9系统已作为一种基因组编辑技术被广泛地研究和利用，该技术利用人工设计的向导RNA(single-guideRNA,sgRNA)介导外源表达的Cas9蛋白与基因组靶点特异性结合，以实现对基因组DNA的特异性切割，切割后的基因组DNA通过非同源末端连接或同源重组的方式进行修复，从而实现基因的敲除、敲入等。相比传统的基因打靶技术如锌指核酸酶(Zinc-fingernucleases，ZFN)和转录激活因子样效应因子核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornucleases，TALEN)，CRISPR/Cas系统技术具有技术流程简易、基因编辑效率高、特异性更强、应用范围更广的优势。然而，作为基因编辑技术，脱靶效应是不可避免的一个缺点，影响了其临床转化应用的进程。因此，如何在提高CRISPR/Cas技术基因编辑效率的同时提高其靶向性，是该技术目前面临的一大难题。
技术实现思路
为解决以上技术问题，本专利技术对pSpCas9载体进行了修饰，提高其靶向性。本专利技术针对已发表文献中的Cas9蛋白的晶体结构(见图1)中DNA序列结合的位点进行氨基酸突变，获得了脱靶效率低的Cas9蛋白，其序列见序列表中序号1的Cas9蛋白序列，晶体形态见图1，其中突变位点有：848号氨基酸位点碱基序列为GCG，对应的氨基酸为丙氨酸；1003号氨基酸位点碱基序列为GCG，对应的氨基酸为丙氨酸；1060号氨基酸位点碱基序列为GCG，对应的氨基酸为丙氨酸。新得到的SpCas9我们命名为SpCas9-SZ。相比现有的CRISPR-Cas9系统技术，本专利技术构建的CRISPR-Cas9系统具有以下优势：1.优化设计的Cas9酶可提高基因编辑靶向性，减少脱靶效应，减少脱靶导致的基因突变。本技术方案使用的是pSpCas9载体。我们在传统的pSpCas9载体中引入了新的点突变，这些点突变位于Cas9蛋白与DNA结合的关键部位，使得改造后的Cas9蛋白能够更加精准地识别目标序列，从而提高基因编辑效率，降低脱靶效应。2.通过各种软件设计、评估后的sgRNA靶向性强，同时，靶位点设计在基因的内含子区域，剪切该内含子后利用同源重组技术，将携带有目的基因的DNA模板重组到细胞的基因组中，可修复下游基因突变，从而达到特异性治疗的目的。该技术方法将基因靶点设计在基因的内含子区域，不用通过剪切外显子来进行基因编辑，同以往的基因编辑相比，降低了基因编辑技术脱靶效应导致的风险。3.该技术方案中，我们利用了腺相关病毒载体(Adeno-associatedVirus,AAV)进行Cas9蛋白和sgRNA的输送。该系统为目前最为安全的病毒载体系统，可以提高基因治疗的安全性。通过实验筛选，我们得到的新的血清型的AAV载体能够显著地提高对一些难转染的细胞如干细胞、神经元细胞的转染效率。4.该技术中设计的Cas9蛋白和sgRNA也可以直接用电转染的方式输送到细胞内。该种方式操作简单，细胞转染效率高，是病毒转染技术的一个良好的补充。附图说明图1Cas9蛋白晶体结构。图2构建好的针对人类IX凝血因子(F9)基因的psgRNA-F9-SpCas9-SZ结构示意图。图3psgRNA-F9-SpCas9-SZ转染HEK293细胞后的细胞观察图片。左侧为明视野下细胞图片；右侧为荧光下细胞图片。图4T7endonucleaseⅠ酶切法检测插入/缺失效率，以验证psgRNA-F9-SpCas9-SZ对人类血红蛋白基因切割效率。图中1为不含psgRNA-F9-SpCas9-SZ的对照组，2～6为psgRNA-F9-SpCas9-SZ编辑后基因酶切结果图。图5T7endonucleaseⅠ酶切法检测插入/缺失效率的统计结果，Data＝Mean±SE,n＝3。图6F9-sgRNA-1的靶向序列和人类基因组其他序列进行比对，从中挑选的3个和F9-sgRNA-4靶向序列最为接近的序列。图7分析psgRNA-F9-SpCas9-SZ的脱靶效率测序结果。图8重组后的细胞表达EGFP荧光图片。图9同源重组后的F9基因的测序结果。图中有四个标注序列区域，其中1.1和1.2为F9基因同源臂，2为EF1启动子，3为EGFP基因序列。具体实施方式实施例1以下根据血友病IX凝血因子(F9)基因突变位点进行HEK293T细胞的基因编辑作为具体基因编辑方案来详细说明本专利技术专利。1.针对F9基因，设计合成5个sgRNA，其序列见下表。其中sgRNA编号1-5的共10个DNA序列依上表顺序见生物序列表中编号2到编号11的序列，且其名称与上表中的名称相对应。每对sgRNA包括两条序列，其中一条为正义链DNA(S)，另一条为反义链DNA(AS)。其中加下划线及斜体部分的序列为和F9基因互补的DNA序列。2.首先配置sgRNADNA正义链和反义链的悬液，使其终浓度为100μM，按以下反应体系进行退火：组分体积比sgRNAS(100μM)1sgRNA-AS(100μM)1T4ligationbuffer，10×1T4PNK1ddH2O6总共1037℃，30min；95℃，5min；以5℃·min-1的速度降至25℃。获得的产物用ddH2O按1:200稀释至总体积为200μl。3.将SpCas9-SZ载体用BbSI进行酶切。按以下反应体系进行酶切和连接反应。组分体积比pSpCas9-SZ，1μg/μl110×NEBbuffer2FastDigestBbsI1ddH2O16总共本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于CRISPR/Cas9基因编辑系统的Cas蛋白突变体，其序列为序列表中序列1所示序列。

【技术特征摘要】
1.一种用于CRISPR/Cas9基因编辑系统的Cas蛋白突变体，其序列为序列表中序列1所示序列。2.一种用于CRISPR/Cas9基因编辑系统的Cas蛋白突变体，其中突变增强位点有：848号氨基酸位点碱基序列为GCG，对应的氨基酸为丙氨酸；1003号氨基酸位点碱基序列为GCG，对应的氨基酸为丙氨酸；1060号氨基酸位点碱基序列为GCG，对应的氨基酸为丙氨酸。3.利用如权利要求1或2所述Cas蛋白进行CRISPR/Cas9系统基因编辑的方法。4.包括权利要求1或2所述蛋白的CRISPR/Cas9基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜舒，纪惜銮，张芸，郭明，
申请(专利权)人：深圳三智医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44