DNA聚合酶及其制备方法技术

本发明专利技术公开了DNA聚合酶及其制备方法。本发明专利技术公开的DNA聚合酶为如下A1)‑A3)中的任一种：A1)对9°N DNA聚合酶的氨基酸序列进行氨基酸残基的置换和/或缺失和/或添加得到的具有DNA聚合酶活性的突变蛋白质；A2)对9°N DNA聚合酶的氨基酸序列进行氨基酸残基的修饰得到的具有DNA聚合酶活性的突变蛋白质；A3)在A1)或A2)的中间或/和N端或/和C端连接标签得到的具有DNA聚合酶活性的融合蛋白质；A1)或A2)所述突变蛋白质与9°N DNA聚合酶相比，与模板DNA的亲和力降低，而DNA聚合酶活性并未降低。

【技术实现步骤摘要】
DNA聚合酶及其制备方法
本专利技术涉及生物
中，DNA聚合酶及其制备方法。
技术介绍
DNA聚合酶(DNApolymerase)是一种参与DNA复制的酶。DNA聚合酶的结构通常由拇指(thumb)、掌(palm)、指(finger)三个亚结构域组成。每个亚结构域都有自己的特殊作用，掌是DNA聚合酶的催化中心，指的主要功能是与核苷酸或核苷酸类似物结合，而拇指的功能与结合模板DNA、持续合成能力有关。已有的研究表明，对拇指结构域的突变主要影响聚合酶与模板DNA的结合与持续合成能力，但是并不会较大的影响聚合酶的其它性质，如催化活性、与核苷酸或核苷酸类似物的亲和力等。Thermococcussp.9°N-7聚合酶，来源于嗜热海洋古菌Thermoccocusssp.9°N-7，该菌是在东太平洋海隆9°N海底热液喷口中分离得到的。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是如何降低DNA聚合酶与模板DNA的结合能力并且不降低DNA聚合酶活性。为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了在9°NDNA聚合酶(简称为DC)序列的基础上，对部分氨基酸残基进行置换或修饰得到的具有DNA聚合酶活性的蛋白质，将其命名为DCm。本专利技术所提供的具有DNA聚合酶活性的蛋白质DCm，为如下A1)-A3)中的任一种：A1)对DC的氨基酸序列进行氨基酸残基的置换和/或缺失和/或添加得到的具有DNA聚合酶活性的突变蛋白质；A2)对DC的氨基酸序列进行氨基酸残基的修饰得到的具有DNA聚合酶活性的突变蛋白质；A3)在A1)或A2)的中间或/和N端或/和C端连接标签得到的具有DNA聚合酶活性的融合蛋白质；A1)或A2)所述突变蛋白质与DC相比，与模板DNA的亲和力降低，而DNA聚合酶活性并未降低。为了使A1)或A2)中的蛋白质便于纯化，可在A1)或A2)的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1、标签的序列标签残基序列Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRRPoly-His2-10(通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述DCm可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述DCm的编码基因可通过将编码DC的DNA序列中进行一个或几个核苷酸的突变，和/或在其序列中间和/或5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。编码DC的DNA序列可为在序列10的第43-2367位的5′端添加ATG得到的序列。序列10的第1位核苷酸为其5′端核苷酸。上述DCm中，DC可为将NCBI中ID为AAA88769.1的第141位的天冬氨酸置换为丙氨酸和第143位的谷氨酸置换为丙氨酸得到的外切酶失活处理的蛋白质。所述DC可为序列表中序列1所示的蛋白质。上述DCm中，所述氨基酸残基的置换和/或缺失和/或添加为一个或几个氨基酸残基的置换和/或缺失和/或添加。A1)中所述DCm与DC具有75％或75％以上同一性。上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。上述DCm中，所述置换可为将氨基酸残基置换为丙氨酸残基。所述置换可为一个或几个氨基酸残基的置换。所述置换具体可为对DC的第674位、第665位、第667位、第668位、第735位和第679位中的至少一个位点进行置换。上述DCm中，所述氨基酸残基的修饰为一个或几个氨基酸残基的修饰。所述修饰具体可为对DC的第674位、第665位、第667位、第668位、第735位和第679位中的至少一个位点进行修饰。上述DCm中，A3)所述融合蛋白质具体可为在A1)或A2)的蛋白质的中间或其氨基末端或羧基末端连接his标签和/或TEV酶识别序列得到的蛋白质。A3)所述融合蛋白质具体可为在A1)或A2)的蛋白质的第1位和第2位氨基酸残基中插入序列表中序列2的第2-14位氨基酸残基得到的蛋白质。上述DCm可为如下B1)-B8)中的任一种：B1)将DC自N端起的第674位的赖氨酸残基置换为丙氨酸残基得到的蛋白质(将该DCm命名为DC5)；B2)将DC自N端起的第665位的谷氨酰胺残基和第667位的苏氨酸残基均置换为丙氨酸残基得到的蛋白质(将该DCm命名为DC24)；B3)将DC自N端起的第668位的精氨酸残基置换为丙氨酸残基得到的蛋白质(将该DCm命名为DC4)；B4)将DC自N端起的第665位的谷氨酰胺残基置换为丙氨酸残基得到的蛋白质(将该DCm命名为DC35)；B5)将DC自N端起的第667位的苏氨酸残基置换为丙氨酸残基得到的蛋白质(将该DCm命名为DC36)；B6)将DC自N端起的第735位的天冬酰胺残基、第665位的谷氨酰胺残基和第667位的苏氨酸残基均置换为丙氨酸残基得到的蛋白质(将该DCm命名为DC40)；B7)将DC自N端起的第679位的组氨酸残基置换为丙氨酸残基得到的蛋白质(将该DCm命名为DC17)；B8)将DC自N端起的第735位的天冬酰胺残基置换为丙氨酸残基得到的蛋白质(将该DCm命名为DC8)。DC5融合蛋白可为序列表中序列2所示的蛋白质；DC24融合蛋白可为序列表中序列3所示的蛋白质；DC4融合蛋白可为序列表中序列4所示的蛋白质；DC35融合蛋白可为序列表中序列5所示的蛋白质；DC36融合蛋白可为序列表中序列6所示的蛋白质；DC40融合蛋白可为序列表中序列7所示的蛋白质；DC17融合蛋白可为序列表中序列8所示的蛋白质；DC8融合蛋白可为序列表中序列9所示的蛋白质。上述DCm具有以下特征：DCm与DNA分子、cDNA分子或含有DNA分子或cDNA分子的生物芯片的亲和力较DC下降。所述生物芯片是指高密度固定在互相支持介质上的生物信息分子(如基因片段、DNA片段或多肽、蛋白质、糖分子、组织等)的微阵列杂交型芯片(micro-arrays)。DCm可以以核苷酸或核苷酸类似物为底物。所述核苷酸类似物为对核苷酸进行修饰得到的物质。所述核苷酸类似物具体可为用荧光基团修饰核苷酸得到的物质。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了与DCm相关的生物材料。本专利技术所提供的与DCm相关的生物材料为下述C1)至C5)中的任一种：C1)编码DCm的核酸分子；C2)含有C1)所述核酸分子的表达盒；C3)含有C1)所述核酸分子的重组载体、或含有C2)所述表达盒的重组载体；C4)含有C1)所述核酸分子的重组微生物、或含有C2)所述表达盒的重组微生物、或含有C3)所述重组载体的重组微生物；C5)含有C1)所述核酸分子的转基因细胞系、或含有C2)所述表达盒的转基因细胞系。上述生物材料中，C1)所述核酸分子可为下述1)、2)或3)：1)将DC的编码基因的序列进行至少一个核苷酸的置换得到的编码DCm的cDNA分子或DNA分子；2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码DCm的cDNA分子或基因组DNA分子；3)在严格条件下与1)限定的核苷酸序列杂交，且编码DCm的cDNA分子或基因组DNA分子。其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。其中，序列10的第43-2367位所示的DNA分子编码序列1的第2-775本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.蛋白质，为如下A1)‑A3)中的任一种：A1)对9°N DNA聚合酶的氨基酸序列进行氨基酸残基的置换和/或缺失和/或添加得到的具有DNA聚合酶活性的突变蛋白质；A2)对9°N DNA聚合酶的氨基酸序列进行氨基酸残基的修饰得到的具有DNA聚合酶活性的突变蛋白质；A3)在A1)或A2)的中间或/和N端或/和C端连接标签得到的具有DNA聚合酶活性的融合蛋白质；A1)或A2)所述突变蛋白质与9°N DNA聚合酶相比，与DNA的亲和力降低，而DNA聚合酶活性并未降低。

【技术特征摘要】
1.蛋白质，为如下A1)-A3)中的任一种：A1)对9°NDNA聚合酶的氨基酸序列进行氨基酸残基的置换和/或缺失和/或添加得到的具有DNA聚合酶活性的突变蛋白质；A2)对9°NDNA聚合酶的氨基酸序列进行氨基酸残基的修饰得到的具有DNA聚合酶活性的突变蛋白质；A3)在A1)或A2)的中间或/和N端或/和C端连接标签得到的具有DNA聚合酶活性的融合蛋白质；A1)或A2)所述突变蛋白质与9°NDNA聚合酶相比，与DNA的亲和力降低，而DNA聚合酶活性并未降低。2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于：9°NDNA聚合酶为序列表中序列1所示的蛋白质；和/或，所述氨基酸残基的置换和/或缺失和/或添加为一个或几个氨基酸残基的置换和/或缺失和/或添加；和/或，所述氨基酸残基的修饰为一个或几个氨基酸残基的修饰。3.根据权利要求1或2所述的蛋白质，其特征在于：所述置换为将9°NDNA聚合酶的氨基酸残基置换为丙氨酸残基；和/或，所述蛋白质为对9°NDNA聚合酶的第674位、第665位、第667位、第668位、第735位和第679位中的至少一个位点进行置换和/或修饰得到的蛋白质。4.根据权利要求1-3中任一所述的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质为如下B1)-B8)中的任一种：B1)将9°NDNA聚合酶自N端起的第674位的赖氨酸残基置换为丙氨酸残基得到的蛋白质；B2)将9°NDNA聚合酶自N端起的第665位的谷氨酰胺残基和第667位的苏氨酸残基均置换为丙氨酸残基得到的蛋白质；B3)将9°NDNA聚合酶自N端起的第668位的精氨酸残基置换为丙氨酸残基得到的蛋白质；B4)将9°NDNA聚合酶自N端起的第665位的谷氨酰胺残基置换为丙氨酸残基得到的蛋白质；B5)将9°NDNA聚合酶自N端起的第667位的苏氨酸残基置换为丙氨酸残基得到的蛋白质；B6)将9°NDNA聚合酶自N端起的第735位的天冬酰胺残基、第665位的谷氨酰胺残基和第667位的苏氨酸残基均置换为丙氨酸残基得到的蛋白质；B7)将9°NDNA聚合酶自N端起的第679位的组氨酸残基置换为丙氨酸残基得到的蛋白质；B8)将9°NDNA聚合酶自N端起的第735位的天冬酰胺残基置换为丙氨酸残基得到的蛋白质。5.根据权利要求1-4中任一所述的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质与DNA分子、cDNA分子或含有DNA分子或cDNA分子的生物芯片的亲和力较9°NDNA聚合酶下降。6.与权利要求1-5中任一所述蛋白质相关的生物材料，其特征在于：所述生物材料为下述C1)至...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈清斌，董宇亮，章文蔚，刘芬，徐崇钧，斯内扎娜·德马纳克，
申请(专利权)人：深圳华大智造科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44