一种葡萄糖氧化酶CnGODA及其基因与应用制造技术

技术编号:19448080 阅读:145 留言:0更新日期:2018-11-14 17:08
本发明专利技术涉及基因工程领域。具体地,本发明专利技术涉及一种葡萄糖氧化酶CnGODA及其基因与应用,其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示,该葡萄糖氧化酶具有良好的性质,可作应用于饲料、食品、医药等工业。根据本发明专利技术的技术方案可以实现利用基因工程手段生产性质优良适合工业应用的葡萄糖氧化酶。

【技术实现步骤摘要】
一种葡萄糖氧化酶CnGODA及其基因与应用
本专利技术涉及基因工程领域。具体地,本专利技术涉及一种葡萄糖氧化酶CnGODA及其基因与应用。
技术介绍
葡萄糖氧化酶(glucoseoxidase,GOD)一种黄素依赖型的需氧脱氢酶,能够在有氧环境下专一性的氧化β-D-葡萄糖,生成葡萄糖酸和过氧化氢。葡萄糖氧化酶广泛地分布于动物、植物和微生物中,由于微生物具有生长繁殖速度快,来源广等特点使之成为葡萄糖氧化酶的主要来源。葡萄糖氧化酶作为饲料添加剂之一,具有巨大的潜在应用价值。另外,葡萄糖氧化酶还具有广泛的应用前景,由于其催化专一性和高效性的优点,已应用于食品、饲料、医药、检测试纸和生物传感器等领域。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新来源的葡萄糖氧化酶。本专利技术的再一目的是提供上述葡萄糖氧化酶的基因。本专利技术的再一目的是提供包含上述葡萄糖氧化酶基因的重组载体。本专利技术的再一目的是提供包含上述葡萄糖氧化酶基因的重组菌株。本专利技术的再一目的是提供一种制备葡萄糖氧化酶的方法。本专利技术的再一目的是提供上述葡萄糖氧化酶的应用。本专利技术首先所要解决的问题是克服现有技术的不足,并提供一种性质优良的、适合于在饲料、食品、医药等行业中应用的新的葡萄糖氧化酶。该葡萄糖氧化酶CnGODA,NCBI序列比对结果显示,其氨基酸序列如SEQIDNO.1:其中,该酶全长614个氨基酸,N端17个氨基酸为信号肽序列“MHSIHFLAAFLAAVSEA”。因此,成熟的葡萄糖氧化酶GOD的理论分子量为64.733kDa,其氨基酸序列如SEQIDNO.2:该葡萄糖氧化酶最适pH为7.0,在pH6.0-pH10.0范围内,该酶能够维持其70%以上的酶活力;最适温度30℃,在15℃-50℃范围内能够维持50%以上的酶活力,具有较良好的温度稳定性。本专利技术通过PCR的方法克隆了这个葡萄糖氧化酶基因CngodA,结果表明,葡萄糖氧化酶cDNA全长1842bp,其cDNA序列如SEQIDNO.3示:其中,信号肽的碱基序列为:“ATGCATTCGATTCATTTCCTAGCTGCTTTCCTGGCTGCAGTCTCTGAAGCT”因此,成熟基因的编码序列为SEQIDNO.4示:成熟蛋白理论分子量为64.733kDa,该酶属于葡萄糖/甲醇/胆碱氧化还原酶家族。将葡萄糖氧化酶基因CngodAcDNA序列及其氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对,确定CnGODA是一种新的葡萄糖氧化酶。本专利技术还提供了包含上述葡萄糖氧化酶基因的重组载体,优选为pPIC9-CngodA。将本专利技术的葡萄糖氧化酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间,使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本专利技术的一个最优选的实施方案,优选为将葡萄糖氧化酶基因插入到质粒pPIC9上的EcoRI和NotI限制性酶切位点之间,使该核苷酸序列位于AOXl启动子的下游并受其调控,得到重组酵母表达质粒pPIC9-CngodA。本专利技术还提供了包含上述葡萄糖氧化酶基因的重组菌株,优选为重组菌株GS115/CngodA。本专利技术还提供了一种制备葡萄糖氧化酶的方法,包括以下步骤:1)用上述重组载体转化宿主细胞,得重组菌株;2)培养重组菌株,诱导重组葡萄糖氧化酶的表达;3)回收并纯化所表达的葡萄糖氧化酶。其中,优选所述宿主细胞为毕赤酵母(Pichiapastoris)细胞、啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)细胞或多型汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)细胞,优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichicpastoris)GS115,得到重组菌株GS115/CngodA。本专利技术还提供了上述葡萄糖氧化酶的应用,运用基因工程手段来产业化生产葡萄糖氧化酶。本专利技术从枝孢菌CladosporiumneopsychrotolernsSL-16菌株中得到了一个新的葡萄糖氧化酶基因,是第一次在这一物种中发现此酶,从而扩展了葡萄糖氧化酶的研究范围,并且该酶也有良好的催化活性,且容易发酵生产。所有这些优点都意味着新发现的葡萄糖氧化酶在饲料、食品、医药等行业中将具有更重要的应用价值。附图说明图1根据本专利技术的具体实施方式的重组葡萄糖氧化酶的最适pH值。图2根据本专利技术的具体实施方式的葡萄糖氧化酶的pH稳定性。图3根据本专利技术的具体实施方式的葡萄糖氧化酶最适反应温度。图4根据本专利技术的具体实施方式的葡萄糖氧化酶热稳定性。具体实施方式试验材料和试剂1、菌株及载体:毕赤酵母(PichiapastorisGS115);毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。2、酶类及其它生化试剂:内切酶购自TaKaRa公司,连接酶购自Invitrogen公司,其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。3、培养基:(1)产酶培养基(/L):葡萄糖172.11g,玉米浆11.05g,碳酸钙52.29g,牛肉蛋白胨3.5g,(NH4)H2PO40.5g,MgSO4·7H2O0.125g,FeSO4·7H2O0.125g。121℃灭菌处理20min。(2)大肠杆菌LB培养基:1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCI,pH7.0。(3)BMGY培养基:1%酵母提取物,2%蛋白胨,1.34%YNB,0.000049<Biotin,1%甘油(v/v)。(4)BMMY培养基:除以0.5%甲醇代替甘油外,其余成份均与BMGY相同。说明:以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法,均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行,或者按照试剂盒和产品说明书进行。实施例1葡萄糖氧化酶编码基因god的克隆(1)提取枝孢菌CladosporiumneopsychrotolernsSL-16总RNA首先,将在产酶培养基中培养3天的菌,收集到滤纸上并压干,加入已高温灭菌的研钵中,液氮迅速研磨至粉末。然后将研磨好的菌体转移至一个新的、装有800μLTrizol的1.5mL离心管中,吹打混匀,室温放置5min。加入200μL氯仿,剧烈振摇15s,室温放置3min,于4℃,12000rpm离心15min。吸取上清,加入等体积异丙醇,混匀,室温放置10min,于4℃,12000rpm离心10min。弃上清,沉淀用70%乙醇洗涤2次,沉淀在空气中干燥5min,加入适量DNase/RNase-Free去离子水溶解RNA。(2)葡萄糖氧化酶cDNA的获取利用Oligo(dT)20和反转录酶得到总cDNA的一条链,然后设计合成带有EcoRI和NotI限制性酶切位点的引物F和R(见表1),对CnGODA的成熟蛋白的编码区进行PCR扩增,获得葡萄糖氧化酶的cDNA序列。表1实施例1所需的引物实施例2葡萄糖氧化酶工程菌株的构建(1)表达载体的构建及在毕赤酵母中的表达利用EcoRI和NotI酶切实施例1中PCR产物,连接进入表达载体pPIC9(Invitrogen,SanDiego),葡萄糖氧化酶GOD成熟蛋白的序列插入到上述表达载体的信号肽序列的下游,与信号肽形成正确的阅读框架,构建成酵母表达载体pPIC9-CngodA,大肠杆菌感受态细胞Trans1,挑选阳性转化子进行DNA测序,测本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种葡萄糖氧化酶CnGODA,其特征在于,其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种葡萄糖氧化酶CnGODA,其特征在于,其氨基酸序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示。2.一种葡萄糖氧化酶基因,其特征在于,编码权利要求1所述的一种葡萄糖氧化酶。3.根据权利要求2所述的葡萄糖氧化酶基因,其特征在于,其核苷酸序列如SEQIDNO.3或SEQIDNO.4所示。4.包含权利要求2所述葡萄糖氧化酶基因的重组表达载体。5.包含权利要求2所述葡萄糖氧化...

【专利技术属性】
技术研发人员:姚斌罗会颖郑菲涂涛苏小运黄火清王苑柏映国王亚茹孟昆
申请(专利权)人:中国农业科学院饲料研究所
类型:发明
国别省市:北京,11

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