一种反式茴香脑加氧酶的突变体和突变株制造技术

本发明专利技术公开了一种反式茴香脑加氧酶的突变体和突变株，所述反式茴香脑加氧酶的突变体与野生型反式茴香脑加氧酶氨基酸序列相比，其185位氨基酸Glu变为Asp，所述反式茴香脑加氧酶的突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示。合成对茴香醛、藜芦醛、洋茉莉醛、香兰素的转化速率分别为原始菌株的1.91、2.08、1.33、1.92倍，5F4在生物法合成芳香醛香料中，展现了良好的应用潜力，同时5F4的催化时pH的适应性更广泛，更适合用工业生产应用，能够降低成本，提高生产效率。

【技术实现步骤摘要】
一种反式茴香脑加氧酶的突变体和突变株
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种反式茴香脑加氧酶的突变体和突变株。
技术介绍
丙烯基苯型精油单分是通过物理的方法从植物精油中提取的某一种丙烯基苯化合物，这类化合物的共同特征是具有丙烯基侧链，并且在苯环上具有甲氧基取代基团，常被作为合成带有苯环结构的名贵香料和药物的起始物(如香草醛、洋茉莉醛、茴香醛等)。由于化学合成香料在香料生产上存有：香料化合物中残留的化学物质给人体健康带来危害、化学合成会带来环境的污染、化学合成反应立体选择性差而导致产物为外消旋体等的缺陷。目前，生物合成香料化合物的技术越来越受到人们的关注。反式茴香脑加氧酶(TAO)，由Han等人最先在恶臭假单胞菌PseudomonasputidaJYR-1中发现，该酶能氧化反式茴香脑合成对茴香醛，同时也能氧化异丁香酚、异黄樟素和对甲氧基异丁香酚，但催化效率不高，E.coliBL21(DE3)(pET-TAO)在含0.5mmol·L-1的葡萄糖和1mmol·L-1的不同底物溶液中,反应6h，能分别合成0.63mmol·L-1对茴香醛和香草醛、0.38mmol·L-1的洋茉莉醛和藜芦醛。
技术实现思路
本部分的目的在于概述本专利技术的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和专利技术名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和专利技术名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本专利技术的范围。鉴于上述的技术缺陷，提出了本专利技术。因此，作为本专利技术其中一个方面，本专利技术克服现有技术中存在的不足，提供一种式茴香脑加氧酶突变体。为解决上述技术问题，本专利技术提供了如下技术方案：一种反式茴香脑加氧酶的突变体，其中：所述反式茴香脑加氧酶的突变体与野生型反式茴香脑加氧酶氨基酸序列相比，其185位氨基酸Glu变为Asp，所述反式茴香脑加氧酶的突变体的氨基酸序列如SEQIDNO1所示。作为本专利技术所述的反式茴香脑加氧酶的突变体的一种优选方案：所述反式茴香脑加氧酶的突变体，其是通过以反式茴香脑加氧酶基因为模板，进行易错PCR，获得反式茴香脑加氧酶的突变体文库，并将所述反式茴香脑加氧酶的反应底物添加入含有反式茴香脑加氧酶的突变体的溶液中进行催化反应，将反应液与2,4-二硝基苯肼进行显色反应，并加入碱溶液及有机溶剂反应，测定吸光度后筛选得到。作为本专利技术所述的反式茴香脑加氧酶的突变体的一种优选方案：所述易错PCR，包括设计易错PCR引物，所述易错PCR引物为：taoF：TTCCAGGGGCCCCTGGGATCCGGATCCATGGAGGACATCATGCtaoD：GTCACGATGCGGCCGCTCGAGCTCGAGTCAGTTAGTCCTCAAGTCG。作为本专利技术所述的反式茴香脑加氧酶的突变体的一种优选方案：所述获得反式茴香脑加氧酶的突变体文库，包括以重组质粒PGEX-6P-1-tao为模板，rTaq聚合酶进行易错PCR获得随机突变，PCR体系中添加浓度为7～10mmol·L-1的Mg2+以及30～250μmol·L-1的Mn2+，PCR产物连接至线性质粒PGEX-6P-1，再将连接产物导入感受态细胞E.coliBL21(DE3)中，获得反式茴香脑加氧酶的突变体文库。作为本专利技术所述的反式茴香脑加氧酶的突变体的一种优选方案：所述进行显色反应，包括，将导入感受态细胞的反式茴香脑加氧酶的突变体文库涂布平板，挑取单菌落接种于含有100mg·L-1的氨苄青霉素的LB培养基中，诱导培养，离心获得菌体，加入100～200μL的缓冲液混匀菌体，添加终浓度为0.1～1.0g·L-1的反式茴香脑加氧酶反应底物，28～37℃催化反应20～120min，取反应上清液与2,4-二硝基苯肼显色剂于10～40℃反应5～40min，再加入0.5～3mol·L-1的NaOH以及0～80％的乙醇溶液，10～40℃溶解沉淀，用酶标仪测定吸光度OD470。作为本专利技术所述的反式茴香脑加氧酶的突变体的一种优选方案：所述反式茴香脑加氧酶的反应底物，包括4-丙烯基-2-甲氧基苯酚、反式-1-甲氧基-4-丙烯基苯、1,2-二甲氧基-4-丙烯基苯。作为本专利技术所述的反式茴香脑加氧酶的突变体的一种优选方案：所述重组质粒PGEX-6P-1-tao，是将来源于恶臭假单胞菌PseudomonasputidaJYR-1的反式茴香脑加氧酶基因连接到质粒PGEX-6P-1。作为本专利技术所述的反式茴香脑加氧酶的突变体的一种优选方案：所述反式茴香脑加氧酶的突变体，其适合催化的pH范围为7～9。作为本专利技术的另一个方面，本专利技术克服现有技术中存在的不足，提供一种式茴香脑加氧酶突变株。为解决上述技术问题，本专利技术提供了如下技术方案：一种式茴香脑加氧酶突变株，其中，所述反式茴香脑加氧酶突变菌株包含权利要求1～8任一所述的反式茴香脑加氧酶的突变体。本专利技术的有益效果：本专利技术通过随机突变反式茴香脑加氧酶，导入到E.ColiBL21(DE3)中，并通过改进显色方法，经过筛选后获得突变重组菌5F4，其合成对茴香醛、藜芦醛、洋茉莉醛、香兰素的转化速率分别为原始菌株的1.91、2.08、1.33、1.92倍，5F4在生物法合成芳香醛香料中，展现了良好的应用潜力，同时5F4的催化时pH的适应性更广泛，更适合用工业生产应用，能够降低成本，提高生产效率。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：图1为5F4全细胞催化丙烯基苯型精油单分合成芳香醛产物HPLC测定图。图2为5F4全细胞催化合成藜芦醛、香兰素的GC-MS图。具体实施方式为使本专利技术的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本专利技术的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本专利技术，但是本专利技术还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本专利技术内涵的情况下做类似推广，因此本专利技术不受下面公开的具体实施例的限制。其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本专利技术至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。实施例1：高通量筛选方法的建立：(1)不同碱溶液对显色的影响分别测定1mol·L-1的NaOH-50％乙醇溶液以及KOH-50％乙醇溶对显色的影响，记录OD470以及稳定性(1h内OD470的最大差值的绝对值与当前使用值得比值)，如表1所示。表1不同碱溶液对显色的影响碱液NaOHKOHOD4702.861.814稳定性0.0160.055结果表明采用NaOH-50％乙醇溶液的OD470响应较高、稳定性较好。(2)不同碱浓度对显色的影响分别测定0.5～3.0mol·L-1的NaOH对显色的影响，记录OD470以及稳定性，如表2所示。表2不同碱浓度对显色的影响结果表明NaOH浓度在1.5-2.0mol·L-1时，OD470稳定。(3)不同有机溶剂对显色的影本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种反式茴香脑加氧酶的突变体，其特征在于：所述反式茴香脑加氧酶的突变体与野生型反式茴香脑加氧酶氨基酸序列相比，其185位氨基酸Glu变为Asp，所述反式茴香脑加氧酶的突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示。

【技术特征摘要】
1.一种反式茴香脑加氧酶的突变体，其特征在于：所述反式茴香脑加氧酶的突变体与野生型反式茴香脑加氧酶氨基酸序列相比，其185位氨基酸Glu变为Asp，所述反式茴香脑加氧酶的突变体的氨基酸序列如SEQIDNO1所示。2.如权利要求1所述的反式茴香脑加氧酶的突变体，其特征在于：所述反式茴香脑加氧酶的突变体，其是通过以反式茴香脑加氧酶基因为模板，进行易错PCR，获得反式茴香脑加氧酶的突变体文库，并将所述反式茴香脑加氧酶的反应底物添加入含有反式茴香脑加氧酶的突变体的溶液中进行催化反应，将反应液与2,4-二硝基苯肼进行显色反应，并加入碱溶液及有机溶剂反应，测定吸光度后筛选得到。3.如权利要求2所述的反式茴香脑加氧酶的突变体，其特征在于：所述易错PCR，包括设计易错PCR引物，所述易错PCR引物为：taoF：TTCCAGGGGCCCCTGGGATCCGGATCCATGGAGGACATCATGCtaoD：GTCACGATGCGGCCGCTCGAGCTCGAGTCAGTTAGTCCTCAAGTCG。4.如权利要求2或3所述的反式茴香脑加氧酶的突变体，其特征在于：所述获得反式茴香脑加氧酶的突变体文库，包括以重组质粒PGEX-6P-1-tao为模板，rTaq聚合酶进行易错PCR获得随机突变，PCR体系中添加浓度为7～10mmol·L-1的Mg2+以及30～250μmol·L-1的Mn2+，PCR产物连接至线性质粒PGEX-6P-1，再将连接产物导入感受态细胞E.coliBL21(DE3)中...

【专利技术属性】
技术研发人员：王玉琴，郑璞，刘思琴，陈鹏程，闻鹏，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32