一种通用性CAR-T细胞、制备方法及应用技术

本发明专利技术提供一种通用性CAR‑T细胞、制备方法及应用，所述通用性CAR‑T细胞可识别多肽GCN及GCN‑自身抗体亲和肽融合多肽，在不同GCN‑自身抗体亲和肽融合多肽引导子的引导和调控下，靶向识别并杀伤不同的自身反应性B细胞。可以很方便的控制CAR‑T细胞体内免疫效应强度或完全关闭，有助于减少一般CAR‑T细胞治疗中的细胞因子风暴等副反应或其它风险，不同于常规CAR‑T细胞需要针对不同的靶标设计不同的CAR；大大节省了时间和成本，提高了成功率。

【技术实现步骤摘要】
一种通用性CAR-T细胞、制备方法及应用
本专利技术属于免疫治疗领域，具体涉及一种通用性CAR-T细胞、制备方法及应用。
技术介绍
CAR-T细胞技术是通过将识别肿瘤相关抗原的单链抗体(scFv)和胞内信号域“免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM，通常为CD3ζ)”在体外进行基因重组，生成重组质粒，再在体外转染天然T细胞，纯化和扩增后的T细胞表达嵌合抗原受体(CAR)，表达CAR的T细胞称为CAR-T细胞。CAR-T细胞能够以抗原依赖、非MHC限制的方式结合肿瘤抗原,启动并活化特异性杀伤肿瘤效应。目前该技术以已经在肿瘤治疗研究领域取得很大进展，2011年JuneCH等首次报道采取这一技术治愈1例慢性淋巴细胞白血病患者，标志着肿瘤生物治疗跨入新纪元。近年来，CAR-T细胞技术不断改良和优化，疗效持续提升，应用范围已覆盖多种血液系统恶性肿瘤及实体肿瘤，单中心的临床病例观察中发现，CAR-T细胞疗法治疗急性淋巴细胞白血病完全缓解率可高达90％，治疗复发抵抗型慢性淋巴细胞白血病有效率达57％，最近也有成功治疗多发性骨髓瘤患者的报道。目前已有超过100项CAR-T细胞治疗的临床试验在美国NIH注册各种固体肿瘤，多项研究为制药巨头诺华、Merck等公司发起，除肿瘤之外，学者也开始尝试利用CAR-T细胞治疗病毒感染性疾病。尽管如此，当前CAR-T细胞治疗技术发展总的特点是：技术与疗效日益进步，但应用范围仍主要限于肿瘤性疾病；另外，在CAR-T细胞治疗领域也存在着一些技术缺陷，通常CAR-T细胞不是通用的没需要根据不同的病人进行制备，制备时间长，制备成本高，对病人病情造成不利影响，其次，难以把控CAR-T细胞的使用强度，易造成细胞因子风暴等副反应或其它风险。自身抗体是多种自身免疫性疾病的直接致病因子，它们与自身抗原结合形成抗原抗体复合物沉积于组织介导炎症损伤。系统性红斑狼疮(SLE)相关的自身抗体因不具组织特异性介导多系统损伤，而在另一些疾病中，自身抗体主要介导某一种组织器官损伤，如特发性膜性肾病(IMN)、IgA肾病(IgAN)、Goodpasture`s病等是由相应的自身抗体介导肾小球病变。据2013年中国肾脏登记系统数据显示，IgA肾病(IgAN)、特发性膜性肾病(IMN)、狼疮性肾炎(LN)是我国慢性肾脏病患者除糖尿病肾脏疾病、高血压肾损害外最主要的肾小球疾病。自身抗体与肾脏疾病关系密切，目前多种肾脏疾病中关键的自身抗体及其抗原已得到鉴定，如PLA2R、Gd-IgA1和anti-dsDNA等，这些肾脏疾病本质是一种自身抗体介导的自身免疫性疾病，研究证明多种自身免疫性疾病是由自身反应性B细胞引起的，迄今为止，还没有出现用于靶向识别并杀伤自身反应性B细胞CAR-T细胞。
技术实现思路
为解决上述技术缺陷，本专利技术提供一种通用性CAR-T细胞、制备方法及应用。具体技术方案如下：一种通用性CAR-T细胞，其不同之处在于，所述通用性CAR-T细胞可识别多肽GCN及GCN-自身抗体亲和肽融合多肽，在不同GCN-自身抗体亲和肽融合多肽引导子的引导和调控下，靶向识别并杀伤不同的自身反应性B细胞。上述技术方案中，所述通用性CAR-T细胞嵌合抗原受体包括CD3ζ区、共刺激区、跨膜区、铰链区、抗GCN单链抗体区及信号肽，所述抗GCN单链抗体区基因序列如SEQIDNO:1所示。上述技术方案中，所述CD3ζ区携带SEQIDNO:2所示基因序列，所述共刺激区携带SEQIDNO:3所示基因序列，所述跨膜区携带SEQIDNO:4所示基因序列，所述铰链区携带SEQIDNO:5所示基因序列，所述信号肽携带SEQIDNO:6所示基因序列。上述通用性CAR-T细胞的制备方法，其不同之处在于：(1)合成抗GCN单链抗体区，其序列如SEQIDNO:1所示；(2)合成含有Hinge-TM-CD137-CD3ζ基因序列的质粒pCD-HTCC；(3)将质粒pCD-HTCC与载体pCDH-CMV-MCS连接获得载体pCDH-CD137-CD3ζ；(4)将anti-GCNscFv与载体pCDH-CD137-CD3ζ相接获得质粒psv-CAR；(5)将质粒psv-CAR转至活化T细胞，获得svCAR-T细胞。上述通用性CAR-T细胞在治疗自身免疫性疾病药物中的应用，其特征在于，所述自身免疫性疾病是由自身反应性B细胞引起，所述通用性CAR-T细胞需通过GCN-自身抗体亲和肽融合多肽引导子的引导和调控，所述GCN-自身抗体亲和肽融合多肽引导子能与所述CAR-T细胞的抗GCN单链抗体区结合。上述技术方案中，所述GCN-自身抗体亲和肽融合多肽引导子包括多肽GCN、连接子以及自身抗体亲和肽，所述多肽GCN序列如SEQIDNO:7所示。上述技术方案中，所述连接子序列如SEQIDNO:8所示。上述技术方案中，所述自身抗体亲和肽通过所述连接子与所述多肽GCN的N端或C端连接。上述技术方案中，所述自身免疫性疾病包括自身免疫性肾病。上述技术方案中，所述通用性CAR-T细胞通过PpN与PpC的引导与调控在治疗特发性膜性肾病药物中的应用；所述通用性CAR-T细胞通过PaN及PaC的引导与调控在治疗IgA肾病药物中的应用；所述通用性CAR-T细胞通过PdN及PdC的引导和调控在治疗狼疮性肾炎药物中的应用；所述通用性CAR-T细胞通过PmaN及PmaC的引导和调控在治疗MPO型-ANCA相关血管炎药物中的应用；所述通用性CAR-T细胞通过PpaN及PpaC的引导和调控在治疗PR3型-ANCA相关血管炎药物中的应用；其中，所述PpN与PpC的自身抗体亲和肽序列如SEQIDNO:19所示，所述PaN与PaC的自身抗体亲和肽序列如SEQIDNO:20所示，所述PdN及PdC的自身抗体亲和肽序列如SEQIDNO:21所示，所述PmaN及PmaC的自身抗体亲和肽序列如SEQIDNO:22所示，所述PpaN及PpaC的自身抗体亲和肽序列如SEQIDNO:23所示。上述技术方案中，PpN序列如SEQIDNO:9所示，PpC序列如SEQIDNO:10所示，PaN序列如SEQIDNO:11所示，PaC序列如SEQIDNO:12所示，PdN序列如SEQIDNO:13所示，PdC序列如SEQIDNO:14所示，PmaN序列如SEQIDNO:15所示，PmaC序列如SEQIDNO:16所示，PpaN序列如SEQIDNO:17所示，PpaC序列如SEQIDNO:18所示。本专利技术的有益效果在于：1)本专利技术设计的通用型CAR-T细胞所表达的CAR是通用的，不同于常规CAR-T细胞需要针对不同病人设计不同的CAR。临床应用时，既缩短了CAR-T细胞制备时间，又降低了制备成本。2)本专利技术设计的通用型CAR-T细胞回输入病人体内后，不会立即攻击异常的自身反应性B细胞，而是需要后续输注融合多肽引导子引导；且攻击效能与输注的融合多肽引导子剂量有关。可以很方便的控制CAR-T细胞体内免疫效应强度或完全关闭，有助于减少一般CAR-T细胞治疗中的细胞因子风暴等副反应或其它风险。3)本专利技术设计的通用型CAR-T细胞联合融合多肽引导子治疗自身免疫性肾病的新方案可以很方便的应对自身免疫性肾病患者自身反应性B细胞的异质性，不同于常规CAR-T细本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种通用性CAR‑T细胞，其特征在于，所述通用性CAR‑T细胞可识别多肽GCN及GCN‑自身抗体亲和肽融合多肽，在不同GCN‑自身抗体亲和肽融合多肽引导子的引导和调控下，靶向识别并杀伤不同的自身反应性B细胞。

【技术特征摘要】
1.一种通用性CAR-T细胞，其特征在于，所述通用性CAR-T细胞可识别多肽GCN及GCN-自身抗体亲和肽融合多肽，在不同GCN-自身抗体亲和肽融合多肽引导子的引导和调控下，靶向识别并杀伤不同的自身反应性B细胞。2.根据权利要求1所述一种通用性CAR-T细胞，其特征在于，所述通用性CAR-T细胞嵌合抗原受体包括CD3ζ区、共刺激区、跨膜区、铰链区、抗GCN单链抗体区及信号肽，所述抗GCN单链抗体区基因序列如SEQIDNO:1所示。3.根据权利要求2所述一种通用性CAR-T细胞，其特征在于，所述CD3ζ区携带SEQIDNO:2所示基因序列，所述共刺激区携带SEQIDNO:3所示基因序列，所述跨膜区携带SEQIDNO:4所示基因序列，所述铰链区携带SEQIDNO:5所示基因序列，所述信号肽携带SEQIDNO:6所示基因序列。4.权利要求1~3任一项所述通用性CAR-T细胞的制备方法，其特征在于：合成抗GCN单链抗体区，其序列如SEQIDNO:1所示；合成含有Hinge-TM-CD137-CD3ζ基因序列的质粒pCD-HTCC；将质粒pCD-HTCC与载体pCDH-CMV-MCS连接获得载体pCDH-CD137-CD3ζ；将anti-GCNscFv与载体pCDH-CD137-CD3ζ相接获得质粒psv-CAR；将质粒psv-CAR转至活化T细胞，获得通用性CAR-T细胞。5.权利要求1~3任一项所述一种通用性CAR-T细胞在治疗自身免疫性疾病药物中的应用，其特征在于，所述自身免疫性疾病是由自身反应性B细胞引起，所述通用性CAR-T细胞需通过GCN-自身抗体亲和肽融合多肽引导子的引导和调控，所述GCN-自身抗体亲和肽融合多肽引导子能与所述CAR-T细胞的抗GCN单链抗体区结合。6.根据权利5所述的应用，其特征在于，所述GCN-自身抗体亲和肽融合多肽引导子包括多肽GCN、连接子以及自身抗体亲和肽，所述多肽GCN氨基酸序列如SEQIDNO:7所...

【专利技术属性】
技术研发人员：王惠明，刁波，王刚，
申请(专利权)人：武汉圣惠康生物医药科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42