一种成纤维细胞的制备方法及其试剂盒技术

本发明专利技术提供一种成纤维细胞的制备方法，其中，所述方法包括从人组织中通过含维生素E、抗坏血酸、槲皮素和成纤维生长因子培养获得成纤维细胞，并慢病毒转染突变体热休克蛋白47基因，制备的成纤维细胞具有良好的生物学活性，高表达的热休克蛋白47突变体与前胶原肽可特异结合，但抑制胶原蛋白加工成熟与转运，从而抑制胶原蛋白过度表达造成的纤维化和瘢痕形成，同时成纤维细胞修复断裂纤维组织和抑制炎症反应，恢复皮肤基底层的胶原蛋白结构；本发明专利技术提供的成纤维细胞将对皮肤瘢痕具有很好治疗和美容效果。

【技术实现步骤摘要】
一种成纤维细胞的制备方法及其试剂盒
本专利技术涉及一种成纤维细胞的方法以及通过所述方法获得的成纤维细胞，尤其可将所述成纤维细胞用于修复皮肤瘢痕。具体地，本专利技术涉及从人组织中通过体外培养获得成纤维细胞，并构建热休克蛋白47的重组病毒载体，使得成纤维细胞能稳定表达热休克蛋白47，高表达的热休克蛋白47突变体与前胶原肽特异结合，但抑制胶原蛋白加工成熟与转运，从而抑制胶原蛋白过度表达造成的纤维化和瘢痕形成，同时成纤维细胞修复断裂纤维组织，恢复皮肤基底层的胶原蛋白结构；将有望对皮肤疤痕达到更佳的治疗和美容效果。
技术介绍
瘢痕肉芽组织经改建成熟形成的纤维结缔组织，其中纤维细胞很稀少，核细长而深染，组织内血管减少。大体上局部呈收缩状态，颜色苍白或灰白半透明，质硬韧并缺乏弹性。手术切除是主要手段，但任何手术方式都不能将瘢痕完全去除，只是最大限度的改善或矫正瘢痕造成的危害，且手术后还宜形成新的瘢痕。对于程度较轻的瘢痕患者，激光、冷冻或放射治疗是比较常用的手段，但易出现色素沉着、浅表性瘢痕、感染、瘙痒等的可能。皮肤病理性瘢痕的成纤维细胞比正常皮肤的成纤维细胞产生更高水平的胶原等细胞外基质，并且其不同的表现型，构成了成纤维细胞的异质性。细胞技术为皮肤瘢痕治疗提供了新的手段，如研究发现胸腺素β4在瘢痕疙瘩组织中表达减少，可以用来作为其的治疗药物；含活性因子的疤痕修复凝胶具有抗纤维母细胞增生、抗炎症和软化、瘢痕组织的作用，以及玛卡祛疤精华胶和含LEYA活性因子的玛卡祛疤精华素均有着阻止受损皮肤色素产生变异，恢复皮肤的正常肤色和弹性。这些手段均对皮肤瘢痕治疗起着很好的效果。但针对皮肤瘢痕形成的真正原因，抑制胶原蛋白过度表达和皮肤纤维化，是治疗其关键的问题。本专利技术利用成纤维细胞为蛋白表达载体及其本身的功能，特别地，对皮肤瘢痕治疗有着很好的效果。成纤维细胞(Fibroblast，FB)已经用于临床治疗领域，在皮肤整形治疗中取得了很好的疗效，已不存在的免疫排斥、伦理学及致瘤性等方面的限制，具有良好的临床应用前景。因而，本专利技术利用体外培养技术获得成纤维细胞，并构建热休克蛋白47突变体的重组病毒载体，转染成纤维细胞，高表达的热休克蛋白47突变体与前胶原蛋白肽特异结合，但抑制胶原蛋白成熟和转运，胶原蛋白过度表达造成的纤维化和瘢痕形成，同时成纤维细胞修复断裂纤维组织，恢复皮肤基底层的胶原蛋白结构，并无成瘤性，有望对皮肤瘢痕修复和美容产生更好的效果。
技术实现思路
本申请专利技术人经过研究发现，作为在皮肤瘢痕形成过程中胶原蛋白特异性分子伴侣，热休克蛋白47在成纤维细胞合成胶原蛋白的过程中发挥重要作用。热休克蛋白47在胶原蛋白分泌细胞的内质网中，与前胶原蛋白肽特异性结合，参与前胶原的折叠、装配、修饰和转运等过程。皮肤瘢痕形成是创面愈合过程中胶原的合成和降解失调，胶原过度沉积的结果；热休克蛋白47表达上调促使了胶原蛋白过量表达，以致创伤皮肤纤维化和瘢痕形成。本专利技术通过将热休克蛋白47辅助前胶原蛋白肽折叠、加工成熟和转运密切相关的活性位点进行定位突变，与前胶原蛋白特异结合，却影响其折叠、加工成熟和转运的过程，抑制瘢痕组织中成纤维细胞胶原蛋白过量表达和纤维化。通过定位突变技术获得10个HSP47突变体，经体内体外实验筛选，发现热休克蛋白47突变体为将第78个位点亮氨酸突变为脯氨酸，或将第132个位点丝氨酸突变为丙氨酸，均能发挥着抑制胶原蛋白过量表达，并阻止皮肤纤维化和瘢痕形成。本专利技术利用成纤维细胞增殖分化和“归巢”的特性，将构建的HSP47突变体基因片段的重组病毒载体转染FBs，可高表达HSP47突变体，发挥HSP47突变体抑制胶原蛋白表达和纤维化的生物学作用及其成纤维细胞本身的功能，改善皮肤局部微环境，修复断裂纤维组织，恢复皮肤基底层的胶原蛋白结构。本申请专利技术人意外发现成纤维细胞高表达HSP47突变体可在瘢痕组织中进入受损成纤维细胞中，抑制胶原蛋白表达以及瘢痕过度形成关系最密切、最具代表性的细胞因子转化生长因子(transforminggrowthfactor-β，TGF-β)的表达，对病理性瘢痕形成的抑制产生了显著的效果。本专利技术提供了一种成纤维细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括构建热休克蛋白47突变体的基因片段，重组到病毒表达载体上，包装成病毒后并转染成纤维细胞，制备成可高表达HSP47的成纤维细胞，提高成纤维细胞发挥更佳的抑制胶原蛋白表达过度表达、阻止成纤维细胞纤维化和改善断裂纤维组织修复，能用于治疗皮肤瘢痕。本专利技术所述的病毒载体，可以在细胞内稳定增殖和表达目的基因，主要为慢病毒、腺病毒、逆转录病毒等，优选地，选择慢病毒表达系统。将人HSP47基因序列通过PCR从正常人外周血基因组DNA中扩增下来，将HSP47的目的DNA片段再进行定点突变，获得HSP47突变体，再分别连接到表达质粒上构建成重组质粒后，经阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定后，构建好的质粒可以保存在-80℃超低温冰箱中。再将HSP47突变体基因片段克隆到慢病载体上，包装好的重组HSP47突变体病毒，可以转染成纤维细胞，制备成HSP47突变体慢病毒转染的成纤维细胞。感染后72小时荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(Greenfluorescentprotein，GFP)的发光情况，GFP显色超过90％以上，表明携带HSP47突变体基因病毒转染成纤维细胞成功，获得持续表达HSP47突变体的成纤维细胞。通过荧光定量PCR试剂盒按照使用说明书检测，转染了HSP47突变体病毒载体的FBs传代培养到第10代后，其表达HSP47突变体基因高于未转染的FBs至少70倍以上。所述的成纤维细胞经免疫荧光技术检测，其标志物α平滑肌肌动蛋白、I型前胶原蛋白α1和III型前胶原蛋白α1表达90％以上。所述转染了重组HSP47突变体病毒的FBs具有如下性能：抑制瘢痕组织成纤维细胞胶原蛋白过度表达和纤维化，抑制炎症反应，修复断裂纤维组织，恢复皮肤基底层的胶原蛋白结构；且无瘤性。本专利技术所述的用于皮肤瘢痕修复的成纤维细胞，可以体外传代培养，即重组HSP47突变体病毒转染的FBs通过无血清培养液(优选其含0.5ng-100ng维生素E、0.5ng-200ng抗坏血酸、10ng-500ng槲皮素、1ng-100ng成纤维生长因子和1×无血清添加物)体外传代培养，当细胞培养到第5-6天，细胞生长融合达到90％以上，需要使用质量体积比为0.25％的胰酶(优选其含0.05％EDTA)消化传代。取传代培养到3代和10代FBs倒置显微镜下观察的细胞形态，未转染的FBs与其他转染目的基因的FBs具有相似的细胞形态。所述用于皮肤瘢痕修复的成纤维细胞过表达HSP47突变体体内、体外成瘤实验中未发现成瘤现象，保证了其安全性。所述用于皮肤瘢痕修复的成纤维细胞在对外与增生性瘢痕成纤维细胞共培养实验中抑制了增生性瘢痕成纤维细胞增殖和胶原合成，以及α-SMA和I型胶原蛋白表达，促使其凋亡发生；在兔瘢痕模型体内移植实验中，与单独的成纤维细胞移植和生理盐水对照组相比，抑制I型胶原蛋白和TGF-β1基因表达，以及炎症因子的TGF-β1分泌，对皮肤瘢痕具有显著修复；体内体外实验表明均无瘤性。本专利技术还提供一种试剂盒产品，其特征在于，所述试剂盒包括：1)成纤本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种成纤维细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括从人组织中提取单细胞，其通过含维生素E、抗坏血酸、槲皮素和成纤维生长因子培养获得成纤维细胞，并慢病毒转染突变体热休克蛋白47(47kDa heat shock protein，HSP47)基因，制备成可高表达热休克蛋白47突变体的成纤维细胞；其中，通过DNA聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)技术扩增热休克蛋白47 cDNA序列，并采用定点突变技术获得HSP47突变体，将其重组构建到表达质粒上，经酶切位点连接到病毒表达载体上，基因重组病毒载体转染成纤维细胞；所述热休克蛋白47突变体为将第78个亮氨酸突变为脯氨酸，或将第132个丝氨酸突变为丙氨酸。

【技术特征摘要】
1.一种成纤维细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括从人组织中提取单细胞，其通过含维生素E、抗坏血酸、槲皮素和成纤维生长因子培养获得成纤维细胞，并慢病毒转染突变体热休克蛋白47(47kDaheatshockprotein，HSP47)基因，制备成可高表达热休克蛋白47突变体的成纤维细胞；其中，通过DNA聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)技术扩增热休克蛋白47cDNA序列，并采用定点突变技术获得HSP47突变体，将其重组构建到表达质粒上，经酶切位点连接到病毒表达载体上，基因重组病毒载体转染成纤维细胞；所述热休克蛋白47突变体为将第78个亮氨酸突变为脯氨酸，或将第132个丝氨酸突变为丙氨酸。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中，感染后72小时荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(Greenfluorescentprotein，GFP)的发光情况，GFP显色超过90％以上；优选，按照荧光定量PCR试剂盒的使用说明书进行检测，转染了热休克蛋白47突变体慢病毒载体的成纤维细胞传代培养到第10代后，其表达热休克蛋白47突变体基因高于未转染的成纤维细胞至少70倍以上；更优选，所述的成纤维细胞经免疫荧光技术检测，其标志物α平滑肌肌动蛋白、I型前胶原蛋白α1和III型前胶原蛋白α1表达90％以上。3.根据权利要求1-2任一项所述的方法，其特征在于，所述转染了热休克蛋白47突变体慢病毒的成纤维细胞具有如下性能：高表达的热休克蛋白47突变体与前胶原肽特异结合，但抑制胶原蛋白加工成熟与转运，从而抑制胶原蛋白过度表达造成的纤维化和瘢痕形成，同时成纤维细胞修复断裂纤维组织和抑制炎症反应，恢复皮肤基底层的胶原蛋白结构；且无瘤性。4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，将人HSP47序列通过PCR从正常人外周血提取的全RNA并逆转录获得cDNA后，使用HSP47引物扩增获得目的片段，HSP47引物为正链：5’-CCGCTCGAGCGGTACGCGAGGGAGGACGAAG-3’，反义链：5’-TCCCCCGGGGGAGATATTGAGCAGAGCGTAG-3’，分别含有XhoI和SmaI酶切位点；将扩增得到的HSP47目的片段分别上述引物和突变特异探针进行基因定位突变，探针序列分别为：5’-CCGGAGCACGGGACCCGAG-3’或5’-CTTCGACCCGCGAGCTGAC-3’，即分别获得HSP47突变体1和突变体2。将获得HSP47突变体和pGMLV-PA1进行XhoI/SmaI双酶切，双酶切后在T4DNA连接酶作用下，于4℃、12小时连接反应制备克隆连接液，转化大肠杆菌感受态细胞DH5a后，进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定；PCR产物凝胶电泳检测和测序鉴定符合HSP47突变体大小和序列后，将测序正确的菌液转接于10ml含氨苄抗生素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，用无内毒素质粒小提中量试剂盒进行质粒抽提，抽提合格的重组质粒放置-80℃超低温冰箱中长期保存；所述HSP47突变体基因片段大小为1272bp；分别将HSP47突变体DNA片段和PGMLV-PA1载体进行XhoI/SmaI双酶切，在T4DNA连接酶作用下，将HSP47片段和酶切PGMLV-PA1载体于37℃、12小时连接反应制备克隆连接液，转化大肠杆菌感受态细胞DH5a后，进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定；取细胞状态良好，处于对数生长期的293T细胞，细胞计数后，按照每个10cm的培养皿6×106个细胞数接种于培养皿中，37℃，5％CO2的培养箱中培养过夜；第二天转染前移去培养液，换5mlOpti-MEM培养液；取9μg包装混合液和3μg慢病毒表达质粒加入1.5mlOpti-MEM中，轻轻混匀，取36μllipofectamine2000加入1.5mlOpti-MEM中，轻轻混匀，室温放置5min；混合质粒溶液和lipofectamine2000稀释液，置室温20min；混合液缓慢滴加至293T细胞的培养液中，混匀，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养；培养6h后弃去含有转染混和物的培养基，加入10ml的PBS液清洗一次，轻柔晃动培养皿以洗涤残余的转染混和物后倒弃；缓慢加入含10％血清的细胞培养基20ml，于37℃、含5％CO2培养箱内继续培养48-72h；根据细胞状态，收集转染后48h的293T细胞上清液；于4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片；以0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；分别配平样品，将带有病毒上清液的超速离心管逐一放入至超速离心机内，设置离心参数为25000rpm，离心时间为2h，离心温度控制在4℃；离心结束后，弃去上清，去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液，反复吹打重悬；经充分溶解后，高速离心10000rpm，离心5min后，取上清荧光法测定滴度，包装好的HSP47突变体慢病毒按照50μl2E+8TU/ml分...

【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：宁波美奈生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33