体外肿瘤细胞3D集体侵袭模型及其构建方法技术

本发明专利技术提供了一种肿瘤3D集体侵袭模型及其构建方法，制备肿瘤多细胞类器官团，细胞中含有光转换荧光蛋白，将其包被于I型鼠尾胶中进行3D培养，体外模拟肿瘤细胞的生长状态、增殖方式和侵袭方式，该模型研究的是肿瘤多细胞球体类器官的集体侵袭作用，更能模拟肿瘤细胞在体内集体侵袭方式，采用激光共聚焦显微镜进行光漂白后，可以在缺乏特异性生物学标记物的情况下对集体侵袭细胞中的Leader Cells与Follower Cells进行区分，并可通过荧光流式分选获得目的区域的肿瘤细胞进行后续实验研究。

【技术实现步骤摘要】
体外肿瘤细胞3D集体侵袭模型及其构建方法
本专利技术涉及医药生物学领域，具体涉及一种体外肿瘤细胞3D集体侵袭模型及其构建方法。
技术介绍
传统的观察体外肿瘤细胞3D模型研究，一种是将单个肿瘤细胞包被入matrigelmatrix胶或者I型鼠尾胶原中进行培养及观察；另一种是将新鲜肿瘤组织标本剪碎处理后，把肿瘤组织小块包被入I型鼠尾胶原中进行培养及观察。传统的单个肿瘤细胞体外3D生长模型能直观观察肿瘤细胞在胶内的生长增殖变化等，但无法观察细胞侵袭情况，难以模拟肿瘤细胞在体内集体侵袭方式；包被I型鼠尾胶原中的新鲜肿瘤组织块是多细胞组织块，虽可观察细胞侵袭生长，但组织块中除肿瘤细胞外还混有多种细胞成分(如血管内皮细胞、成纤维细胞、肌细胞等)，发生侵袭的细胞不能直接判定是否为肿瘤细胞，且难以获得目的区域的肿瘤细胞，尤其是在缺乏特异性生物学标记的情况下，难以对集体侵袭细胞中的LeaderCells和FollowerCells进行区分，不利于对于肿瘤侵袭的后续深入研究。
技术实现思路
基于此，针对上述问题，本专利技术的其中一个目的在于提供一种构建体外肿瘤细胞3D集体侵袭模型，该模型能够模拟肿瘤细胞集体侵袭过程、且易分离得到目的区域肿瘤细胞进行后续研究。为实现上述目的，本专利技术提供了如下技术方案：一种体外肿瘤细胞3D集体侵袭模型的构建方法，包括以下步骤：(1)培养得到肿瘤多细胞球体；所述肿瘤多细胞球体中的肿瘤细胞可表达光转换荧光蛋白；(2)向激光共聚焦培养皿中加入所述肿瘤多细胞球体与I型鼠尾胶原的混合液；待凝固后，加入培养基、继续培养；(3)所述肿瘤多细胞球体在I型鼠尾胶原内伸展侵袭生长，至出现明显的集体侵袭细胞群时，使用激光共聚焦显微镜对所需特定区域的肿瘤细胞进行漂白光转化，使肿瘤细胞中的光转换荧光蛋白由绿色荧光转换为红色荧光；(4)加入胶原酶消化、离心、重悬，制得细胞悬液；(5)流式细胞仪分选以获得所需特定区域的肿瘤细胞。在其中一些实施例中，所述培养得到肿瘤多细胞球体，其步骤包括：向肿瘤细胞中转染入可表达光转换荧光蛋白的质粒，利用超高速流式细胞分选系统分选出可进行光转换荧光肿瘤细胞；采用悬滴培养法或微孔板培养法，将所述光转换荧光肿瘤细胞培养成肿瘤多细胞球体。在其中一些实施例中，所述利用超高速流式细胞分选系统分选：分选至少两次，每次间隔大于7天。在其中一些实施例中，所述微孔板培养法为：计数5000-10000个肿瘤细胞重悬液，将其加入96孔黑色圆底超低吸附球体培养微孔板。在其中一些实施例中，所述步骤(2)为，先在激光共聚焦培养皿中均匀铺设一层I型鼠尾胶原，再向激光共聚焦培养皿中加入所述肿瘤多细胞球体与I型鼠尾胶原的混合液。在其中一些实施例中，步骤(2)中所述待凝固为于(5±0.2)％的CO2、(37±0.5)℃条件下放置25～35min；和/或所述的培养基为含有8％-12％胎牛血清的培养基；和/或所述培养为：于(5±0.2)％的CO2、(37±0.5)℃条件下培养。在其中一些实施例中，步骤(3)所述肿瘤多细胞球体在I型鼠尾胶原内伸展侵袭生长过程中，还包括利用激光共聚焦显微镜的时间序列拍摄方法，记录所述肿瘤多细胞球在I型鼠尾胶原内不同时间点伸展侵袭生长的形态。在其中一些实施例中，步骤(3)所述激光漂白荧光蛋白光转化为：选定所需转化的细胞，利用倒置激光共聚焦显微镜划定需要转化的范围；使用波长为360～420nm或者460～500nm的激光进行荧光的连续激光漂白，至荧光蛋白的荧光颜色转变。在其中一些实施例中，步骤(4)为所述制得细胞悬液为，加入胶原酶消化I型鼠尾胶原，于36.5～37.5℃，消化5～7min，800～1200rpm离心4～7min收集肿瘤细胞，以含2％胎牛血清的PBS重悬细胞。本专利技术的另一个目的还在于提供一种体外肿瘤细胞3D集体侵袭模型。基于上述目的，具体技术方案如下：一种体外肿瘤细胞3D集体侵袭模型，由如上所述的体外肿瘤细胞3D集体侵袭模型的构建方法构建得到。基于上述技术方案，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术经过专利技术人创造性劳动，通过制备得到肿瘤多细胞球并特定配合I型鼠尾胶，构建肿瘤多细胞类器官团，将其包被于I型鼠尾胶中进行3D培养，体外模拟肿瘤细胞的生长状态、侵袭方式，且该模型可于倒置激光共聚焦显微镜下观察到肿瘤多细胞球的侵袭生长状态，并能够识别肿瘤细胞集体侵袭过程中的LeaderCells与FollowerCells；而肿瘤细胞内转入可进行荧光转化的质粒，用倒置激光共聚焦显微镜激光漂白功能作用下对特定区域的肿瘤细胞进行荧光光转化，由原来的绿色荧光转变为红色荧光，利用流式细胞仪分选系统，对不同荧光的细胞进行分选，在无需特异性生物学标记物的情况下，即可对集体侵袭中的LeaderCells与FollowerCells进行区分，得到所需要的特定区域的肿瘤细胞，进行后续的进一步实验研究。而且，本专利技术向肿瘤细胞中转染入可表达光转换荧光蛋白的质粒后，还利用流式细胞分选系统对转入可表达光转换荧光蛋白的质粒的肿瘤细胞进行分选至少两次，每次间隔一段时间，以保证肿瘤细胞表达光转换荧光蛋白的持久性及纯度。优选96孔黑色圆底超低吸附球体培养微孔板是因其具有细胞球中含有的数量的可控性，对于肿瘤研究中的量化指标有利。另外，在激光共聚焦培养皿中先均匀铺设一层I型鼠尾胶原，再加入肿瘤多细胞球和I型鼠尾胶原的混合液，可使得肿瘤细胞球体与激光共聚焦培养皿玻璃底之间存在一定的I型鼠尾胶原形成的距离，确保肿瘤细胞球体不会贴壁生长，以保证侵袭模型模拟体内侵袭的相似程度。同时，向激光共聚焦培养皿中加入肿瘤细胞球体与I型鼠尾胶原的悬液后，放入5％CO2、37℃细胞培养箱中迅速使I型鼠尾胶原完全凝固。该培养模式目的为确保肿瘤细胞球体能完全悬浮于I型胶原当中，使肿瘤细胞完全处于3D的I型鼠尾胶原环境中伸展侵袭。流式分选时重悬制得细胞悬液中，采用含有1.8～2.2％胎牛血清的PBS进行重悬的目的是为了提高细胞耐受性及活性，尽量减少细胞损伤影响细胞活性，从而影响模型与体内状态的相似性。相比于传统的肿瘤研究模型，本专利技术研究肿瘤集体侵袭模型具有以下优势：第一，该模型研究的是肿瘤多细胞球体类器官的集体侵袭作用，更能模拟肿瘤细胞在体内集体侵袭方式；第二，该模型可以更直观的动态观察并记录肿瘤细胞集体侵袭的过程，使定向侵袭可视化；第三，该模型可以在缺乏特异性生物学标记物的情况下对集体侵袭细胞中的LeaderCells与FollowerCells进行区分，并可通过荧光流式分选获得目的区域的肿瘤细胞进行后续实验研究。附图说明图1为结直肠癌细胞SW620转染光转化质粒流式分选后效率图；图2为转染光转化质粒带绿色荧光的结直肠癌细胞SW620在96孔黑色圆底超低吸附球体培养微孔板内形成的紧密多细胞球体类器官；图3为96孔黑色圆底超低吸附球体培养微孔板(Corning)结构示意图；图4为在96孔黑色圆底超低吸附球体培养微孔板内形成的紧密多细胞球体的示意图；图5和图6为其中一实施中通过体外肿瘤细胞3D集体侵袭模型作用的激光共聚焦培养皿的结构示意图；图7为结直肠癌肿瘤细胞HT29及SW620培养成肿瘤多细胞紧密球体后，不同时间段生长侵袭的激光共聚焦显微镜观察结果图；图8为转染光转化质本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种体外肿瘤细胞3D集体侵袭模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)培养得到肿瘤多细胞球体；所述肿瘤多细胞球体中的肿瘤细胞可表达光转换荧光蛋白；(2)向培养皿中加入I型鼠尾胶原与所述肿瘤多细胞球体的混合液；待凝固后，加入培养基、继续培养；(3)所述肿瘤多细胞球体在I型鼠尾胶原内伸展侵袭生长，至出现明显的集体侵袭细胞群时，使用激光共聚焦显微镜对所需区域的肿瘤细胞进行激光漂白荧光蛋白光转化，使所需区域的肿瘤细胞中的光转换荧光蛋白由绿色荧光转换为红色荧光；(4)加入胶原酶消化、离心、重悬，制得细胞悬液；(5)流式细胞仪分选以获得所需区域的肿瘤细胞。

【技术特征摘要】
1.一种体外肿瘤细胞3D集体侵袭模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)培养得到肿瘤多细胞球体；所述肿瘤多细胞球体中的肿瘤细胞可表达光转换荧光蛋白；(2)向培养皿中加入I型鼠尾胶原与所述肿瘤多细胞球体的混合液；待凝固后，加入培养基、继续培养；(3)所述肿瘤多细胞球体在I型鼠尾胶原内伸展侵袭生长，至出现明显的集体侵袭细胞群时，使用激光共聚焦显微镜对所需区域的肿瘤细胞进行激光漂白荧光蛋白光转化，使所需区域的肿瘤细胞中的光转换荧光蛋白由绿色荧光转换为红色荧光；(4)加入胶原酶消化、离心、重悬，制得细胞悬液；(5)流式细胞仪分选以获得所需区域的肿瘤细胞。2.根据权利要求1所述的体外肿瘤细胞3D集体侵袭模型的构建方法，其特征在于，所述培养得到肿瘤多细胞球体的步骤包括：向肿瘤细胞中转染入可表达光转换荧光蛋白的质粒，利用超高速流式细胞分选系统分选出可进行光转换荧光肿瘤细胞；采用悬滴培养法或微孔板培养法，将所述光转换荧光肿瘤细胞培养成肿瘤多细胞球体。3.根据权利要求2所述的体外肿瘤细胞3D集体侵袭模型的构建方法，其特征在于，所述利用超高速流式细胞分选系统分选为：分选至少两次，每次间隔大于7天。4.根据权利要求2所述的体外肿瘤细胞3D集体侵袭模型的构建方法，其特征在于，所述微孔板培养法为：计数5000-10000个肿瘤细胞重悬液，将其加入96孔黑色圆底超低吸附球体培养微孔板。5.根据权利要求1所述的体外肿瘤细胞3D集体侵袭模型的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)为，先在激光共聚焦培养皿中均匀铺设一层I型鼠尾胶原，再向激光...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁莉，王斐斐，朱孝辉，丁彦青，
申请(专利权)人：南方医科大学，
类型：发明
国别省市：广东,44