一种人结直肠癌西妥昔单抗耐药细胞株及其应用制造技术

技术编号:19448010 阅读:54 留言:0更新日期:2018-11-14 17:07
本发明专利技术公开了属于生物医学技术领域的一种人结直肠癌西妥昔单抗耐药细胞株。本发明专利技术利用不同浓度的西妥昔单抗处理人结直肠癌细胞株NCI‑H508,以50%细胞能够存活的药物浓度作为初始浓度长期处理细胞,直至NCI‑H508细胞能在此浓度下正常生长,通过逐渐加量法继续长期处理NCI‑H508细胞,历时6个月,最终获得了能在西妥昔单抗处理下快速生长的人结直肠癌西妥昔单抗耐药细胞株NCI‑H508/C225。本发明专利技术可用于分析人结直肠癌细胞西妥昔单抗耐药后的形态学及生物学表型的变化;研究结直肠癌对西妥昔单抗耐药的分子机制和逆转耐药的方法及筛选其他抗肿瘤药物;发现肿瘤耐药标志物以及筛选和评估新型抗肿瘤药物等,具有较高的科研和生产应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种人结直肠癌西妥昔单抗耐药细胞株及其应用
本专利技术属于生物医学
,具体涉及一种人结直肠癌西妥昔单抗耐药细胞株。
技术介绍
结直肠癌(CRC),是消化系统常见的恶性肿瘤之一,其发病率居我国消化系统恶性肿瘤的第1位。近年来,随着饮食习惯及生活方式的改变,CRC的发病率呈逐年上升趋势,且5年生存率低、预后较差。多数结直肠癌患者发现时已处于晚期,失去手术时机。药物治疗是晚期结直肠癌患者的主要治疗手段,但治疗过程中患者经常出现耐药现象,成为化学治疗的瓶颈。因此,研究结直肠癌细胞耐药机制及其预防或逆转结直肠癌耐药的发生,对于提高化学药物治疗效果十分必要;建立肿瘤耐药细胞株对于研究肿瘤耐药机制、肿瘤细胞耐药性逆转、开发及评价新药等具有重要的应用价值。肿瘤靶向治疗药物由于治疗药物的效率高、靶向性较好、毒性低,在缓解患者病情、控制肿瘤的发展和改善患者生活质量方面有更广阔的发展前景。西妥昔单抗是第一个获准上市的靶向作用于表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)的IgG单克隆抗体。西妥昔单抗与肿瘤细胞表面的EGFR特异性结合后阻断受体的二聚化、酪氨酸激酶的磷酸化以及信号传导,通过EGFR下游信号通路传递凋亡信号到胞核内,发挥抑制细胞增殖、促进细胞凋亡的作用,并抑制肿瘤细胞DNA的修复,发挥抗肿瘤作用。2004年美国食品药品监督局批准EGFR-TKI类药物西妥昔单抗(Cetuximab)用于表皮生长因子受体过度表达的转移性直肠癌的治疗。目前尚缺乏对西妥昔单抗耐药的结直肠癌细胞株,肿瘤耐药细胞株的构建方法也亟需改进。专利技术内容本专利技术的目的在于提供一种人结直肠癌西妥昔单抗耐药细胞株NCI-H508/C225,其保藏编号为CCTCCNO:C201878,保藏单位为中国典型培养物保藏中心,保藏地址为中国.武汉.武汉大学,保藏时间为2018年4月26日。上述的一种人结直肠癌西妥昔单抗耐药细胞株,按照如下步骤获得:步骤一,取人结直肠癌细胞株NCI-H508细胞复苏后置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液,于37℃,5%的CO2培养箱中培养;步骤二,取步骤一所述的生长至对数生长期的NCI-H508细胞种于96孔培养皿中,分别加入0.1μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/L的西妥昔单抗,72小时后,通过CCK-8法检测细胞活力,计算细胞生长抑制率,得到西妥昔单抗对NCI-H508细胞株的半数抑制浓度(IC50)为10μg/ml;步骤三,使用10μg/ml的西妥昔单抗长期刺激NCI-H508细胞,刺激72h后用不含西妥昔单抗的RPMI1640完全培养液培养96h,待NCI-H508细胞能在10μg/ml西妥昔单抗处理下正常生长后,增加西妥昔单抗的浓度至20μg/ml,重复上述过程直至西妥昔单抗浓度加至160ug/ml,计算耐药株的IC50,以确定耐药株对西妥昔单抗的耐药程度,获得人结直肠癌西妥昔单抗耐药细胞株。本专利技术的主要技术方案是利用不同浓度的西妥昔单抗处理人结直肠癌细胞株NCI-H508,以50%细胞能够存活的药物浓度作为初始浓度长期处理细胞,直至NCI-H508细胞能在此浓度下正常生长,通过逐渐加量法继续长期处理NCI-H508细胞,历时6个月,最终获得了能在西妥昔单抗处理下快速生长的人结直肠癌西妥昔单抗耐药细胞株NCI-H508/C225。本专利技术通过形态学观察、生长曲线测定、稳定性测定、DNA突变检测,评价人结直肠癌西妥昔单抗耐药细胞株NCI-H508/C225的生物学特性,成功建立NCI-H508/C225耐药株。本专利技术还提供了人结直肠癌西妥昔单抗耐药细胞株NCI-H508/C225在筛选抗肿瘤药物中的应用。本专利技术还提供了人结直肠癌西妥昔单抗耐药细胞株NCI-H508/C225在制备抗肿瘤药物中的应用。本专利技术还提供了人结直肠癌西妥昔单抗耐药细胞株NCI-H508/C225在研究化疗耐药机制中的应用。有益效果:本专利技术可用于分析人结直肠癌细胞西妥昔单抗耐药后的形态学及生物学表型的变化;研究结直肠癌对西妥昔单抗耐药的分子机制和逆转耐药的方法及筛选其他抗肿瘤药物;发现肿瘤耐药标志物以及筛选和评估新型抗肿瘤药物等,具有较高的科研和生产应用价值。附图说明图1为光学显微镜下人结直肠癌西妥昔单抗敏感细胞株NCI-H508细胞形态图。图2为光学显微镜下人结直肠癌西妥昔单抗耐药细胞株NCI-H508/C225细胞形态图。图3为不同浓度西妥昔单抗处理72小时后,NCI-H508和耐药细胞NCI-H508/C225细胞活力图。图4为不同浓度西妥昔单抗处理72小时后,NCI-H508和撤药8周后NCI-H508/C225细胞活力图。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术作详细描述,但本专利技术的实施不仅限于此。实施例所用的人结直肠癌细胞NCI-H508购置美国全球生物资源中心;实施例所用的西妥昔单抗为市售的德国默克公司的5mg/ml规格的产品。实施例11.人结直肠癌西妥昔单抗耐药细胞株NCI-H508/C225的诱导建立验证①取NCI-H508细胞复苏后置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液,于37℃,5%的CO2培养箱中培养;为找寻最适宜西妥昔单抗刺激浓度,取对数生长期的所述NCI-H508细胞种于96孔培养皿中,分别加入0.1μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/L的西妥昔单抗,72小时后,通过CCK-8法检测细胞活力,计算细胞生长抑制率,得到西妥昔单抗对NCI-H508细胞株的半数抑制浓度(IC50)。②使用上述检测出的IC50值约10μg/ml长期刺激NCI-H508细胞,每次刺激72h后换上不含有西妥昔单抗的RPMI1640完全培养液培养96h。待NCI-H508细胞能在10μg/ml西妥昔单抗处理下正常生长后,增加西妥昔单抗的浓度至20μg/ml,重复此过程直至西妥昔单抗浓度加至160ug/ml,计算耐药株的IC50,以确定耐药株对西妥昔单抗的耐药程度。历时6个月左右最终获得能在西妥昔单抗处理下正常生长的人结直肠癌西妥昔单抗耐药细胞株NCI-H508/C225。将上述细胞与NCI-H508对照细胞接种96孔板(每孔5000个细胞),24小时后加入不同浓度的西妥昔单抗(1、5、10、20、50、100、200μg/ml),于72小时吸弃培养基,每孔各加100μL无血清培养液和10μLCCK8工作液共计110μL的混合物,在培养箱中培养1-2小时后,放入酶标仪以450nm波长检测,读出每孔的OD值并计算平均值,计算细胞活力即OD值平均值/对照组OD值,以西妥昔单抗浓度为横坐标、细胞活力为纵坐标,绘制成药物抑制曲线图(图3),计算耐药株的耐药指数,即耐药细胞IC50/敏感细胞IC50。2.人结直肠癌西妥昔单抗耐药细胞株NCI-H508/C225的形态学观察①倒置相差显微镜观察活细胞形态:分别取对数生长期的NCI-H508对照细胞和NCI-H508/C225耐药细胞,PBS清洗换液后,在倒置显微镜(200X)下观察活细胞形态。通过光镜可以观察到本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人结直肠癌西妥昔单抗耐药细胞株,其特征在于,其保藏编号为CCTCC NO:C201878。

【技术特征摘要】
1.一种人结直肠癌西妥昔单抗耐药细胞株,其特征在于,其保藏编号为CCTCCNO:C201878。2.根据权利要求1所述一种人结直肠癌西妥昔单抗耐药细胞株,其特征在于,按照如下步骤获得:步骤一,取人结直肠癌细胞株NCI-H508细胞复苏后置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液,于37℃,5%的CO2培养箱中培养;步骤二,取步骤一所述的生长至对数生长期的NCI-H508细胞种于96孔培养皿中,分别加入0.1μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/L的西妥昔单抗,72小时后,通过CCK-8法检测细胞活力,计算细胞生长抑制率,得到西妥昔单抗对NCI-H508细胞株的半数抑制...

【专利技术属性】
技术研发人员:井昶雯吴建中马蓉曹海霞王卓
申请(专利权)人:江苏省肿瘤医院
类型:发明
国别省市:江苏,32

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