体外感染猪圆环病毒2型建立猪肺泡巨噬细胞炎症模型的方法技术

本发明专利技术公开了一种体外感染猪圆环病毒2型建立猪肺泡巨噬细胞炎症模型的方法，即采用猪圆环病毒2型体外感染猪肺泡巨噬细胞系。该模型构建成本低、实用性强、技术先进。应用本发明专利技术建立猪肺泡巨噬细胞炎症体外模型后，通过测定病毒感染后细胞活性和炎性因子水平，可探讨PCV2病毒感染量、感染时间与细胞炎性因子水平及活性氧水平动态变化的相关性。因此，本发明专利技术为研究PCV2感染后能否引起免疫细胞炎症及作用机制提供了较理想的体外模型，进而将有可能为PCV2感染引起的动物疾病的治疗提供一些新思路。

【技术实现步骤摘要】
体外感染猪圆环病毒2型建立猪肺泡巨噬细胞炎症模型的方法
本专利技术属于细胞炎症模型
，尤其涉及一种体外感染猪圆环病毒2型建立猪肺泡巨噬细胞炎症模型的方法。
技术介绍
猪圆环病毒2型(PorcineCircovirustype2，PCV2)是引起猪圆环病毒病(PCVD)和猪圆环病毒相关疾病(PorcineCircovirus-AssociatedDisease，PCVAD)的主要病原。近年来，随着养猪业的发展，猪圆环病等传染性疾病的流行，给全球养猪业造成了严重的经济损失。PCV2病毒主要侵害动物体的单核-巨噬细胞和抗原提呈细胞，PCV2感染后可引起的淋巴滤泡破坏和白细胞减少症可以导致猪的免疫抑制病等。猪肺泡巨噬细胞(porcinealveolarmacrophage，PAM)是肺部免疫最早接触病原微生物的免疫防御细胞之一，在猪执行天然免疫和特异性免疫时起重要功能。在生理条件下，肺泡巨噬细胞的主要作用是清除组织内细胞碎片等，主要发挥抑炎作用，但对于组织损伤或是致病微生物等，肺泡巨噬细胞需要启动强大的促炎反应以维持组织稳态。当肺部受到损伤或是感染时，肺泡巨噬细胞的促炎作用强于抑炎作用，肺泡巨噬细胞可以产生并释放大量的炎症介质，如细胞因子、趋化因子、补体、危险信号分子等。这些炎症介质中有些为趋化因子，可以招募单核细胞和中性粒细胞，或作为刺激剂激活肺上皮细胞和间质巨噬细胞，从而建立肺部炎症环境。PCV2感染后，猪肺泡巨噬细胞作为PCV2的靶细胞，是首先抵御肺部损伤的重要免疫细胞。PCV2感染猪肺泡巨噬细胞的程度也是病猪的肺部损伤程度的一个重要参考。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种体外感染猪圆环病毒2型建立猪肺泡巨噬细胞炎症模型的方法，为研究PCV2感染后能否引起免疫细胞炎症及作用机制提供较理想的体外模型。为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：体外感染猪圆环病毒2型建立猪肺泡巨噬细胞炎症模型的方法，采用猪圆环病毒2型体外感染猪肺泡巨噬细胞系(3D4/2细胞)。上述体外感染猪圆环病毒2型建立猪肺泡巨噬细胞炎症模型的方法，包括以下步骤：(1)3D4/2细胞经复苏传代后，待细胞达到一定数量后，细胞计数仪计数活细胞数>95％，调整细胞浓度备用；(2)设置细胞对照组和不同浓度PCV2病毒感染组，加入DMEM培养液及相应浓度病毒液，与细胞吸附2h后弃液，加入1mL含5％FBS的DMEM培养液后继续培养，分别于第4、8、12、24、48h收样，用于细胞活性及与细胞分泌炎性相关因子指标的测定，确定病毒最适孵育浓度和炎症最适孵育时间。步骤(1)按以下操作进行：3D4/2细胞复苏后，用含10％-FBS-DMEM培养液转入瓶中，于37℃、5％CO2培养箱中培养，待细胞长至70％-80％时进行传代，传代时用0.25％胰酶消化后以1∶2或者1∶3的比例进行传代培养，待细胞达到一定数量后，细胞计数仪计数活细胞数>95％，调整细胞浓度为1×106cell/mL备用。步骤(2)按以下操作进行：分别设置细胞对照组和4个不同浓度PCV2病毒感染组，每组4个重复，按1000μL/孔加至24孔板内，培养过夜使细胞贴壁后弃去培养液，PBS缓冲液洗2次，细胞对照组加入无血清DMEM培养液500μL，病毒组加入等量用不含血清的DMEM培养液稀释的不同浓度病毒液，37℃、5％CO2培养箱中吸附2小时，弃去病毒液，PBS缓冲液清洗3次后每孔加入1mL含5％-FBS-DMEM培养液后继续培养，分别于第4、8、12、24、48h收样，用于后续指标测定。PCV2病毒感染组分为4个不同浓度，分别是100、10-1、10-2、10-3PCV2。指标包括细胞NO分泌水平、ROS(细胞内总活性氧)水平、GSH(还原型谷胱甘肽)含量、XOD(黄嘌呤氧化酶活性)、MPO(髓过氧化物酶活性)、iNOS(诱生型一氧化氮合酶)活性及IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10、IFN-γ、IL-8、MCP-1、COX-1、COX-2等炎性因子水平。针对猪圆环病毒2型感染缺乏可用体外炎症模型的问题，专利技术人首次使用猪圆环病毒2型(PCV2)作为诱因，建立了一种体外感染猪圆环病毒2型建立猪肺泡巨噬细胞炎症模型的方法，即采用猪圆环病毒2型体外感染猪肺泡巨噬细胞系(3D4/2细胞)。该模型构建成本低、实用性强、技术先进。应用本专利技术建立猪肺泡巨噬细胞炎症体外模型后，通过测定病毒感染后细胞活性、细胞分泌一氧化氮(·NO)的水平、细胞内总活性氧(ROS)水平、还原型谷胱甘肽(GSH)含量、黄嘌呤氧化酶(XOD)活性、髓过氧化物酶(MPO)活性、诱生型一氧化氮合酶(iNOS)活性及IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10、IFN-γ、IL-8、MCP-1、COX-1、COX-2等炎性因子水平，可探讨PCV2病毒感染量、感染时间与细胞炎性因子水平及活性氧水平动态变化的相关性。因此，本专利技术为研究PCV2感染后能否引起免疫细胞炎症及作用机制提供了较理想的体外模型，进而将有可能为PCV2感染引起的动物疾病的治疗提供一些新思路。与现有技术相比，本专利技术的猪肺泡巨噬细胞炎症模型的建立方法具有以下优点：1、本专利技术首次使用猪圆环病毒2型(PCV2)作为诱因，建立猪肺泡巨噬细胞炎症模型。2、本专利技术确定了PCV2的最佳感染浓度(滴度为102.5TCID50/0.1mL)和孵育时间及猪肺泡巨噬细胞炎症最适孵育时间(4～24h)。3、本专利技术首次使用IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10、IFN-γ、IL-8、MCP-1、COX-1、COX-2等炎性因子水平及细胞NO分泌水平、ROS水平、GSH、含量、XOD、MPO、iNOS活性作为活性氧相关的炎症状态的相关评价指标。4、本专利技术所述的培养条件和方法，能够帮助初次进行PCV2诱导猪肺泡巨噬细胞炎症研究的人员较顺利的建立猪肺泡巨噬细胞活性氧相关的炎症模型。附图说明图1是PCV2感染对3D4/2细胞存活率的变化图。图2是PCV2感染3D4/2细胞对NO分泌的变化图。图3是PCV2感染3D4/2细胞对ROS水平的变化图。图4是PCV2感染3D4/2细胞对细胞分泌TNF-α的变化图。图5是PCV2感染3D4/2细胞对细胞分泌IL-1β的变化图。图6是PCV2感染3D4/2细胞对细胞分泌IL-6的变化图。图7是PCV2感染3D4/2细胞对细胞分泌IL-8的变化图。图8是PCV2感染3D4/2细胞对细胞分泌IL-10的变化图。图9是PCV2感染3D4/2细胞对细胞分泌INF-γ的变化图。图10是PCV2感染3D4/2细胞对细胞分泌MCP一1的变化图。图11是PCV2感染3D4/2细胞对细胞分泌COX-1的变化图。图12是PCV2感染3D4/2细胞对细胞分泌COX-2的变化图。图13是PCV2感染3D4/2细胞对细胞内XOD活性的变化图。图14是PCV2感染3D4/2细胞对细胞内MPO活性的变化图。图15是PCV2感染3D4/2细胞对细胞内GSH含量的变化图。图16是PCV2感染3D4/2细胞对细胞内iNOS活性的变化图具体实施方式一、实验方法(1)3D4/2细胞的培养：3D4/2细胞复苏后用含10％胎牛血清的DMEM培养液本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种体外感染猪圆环病毒2型建立猪肺泡巨噬细胞炎症模型的方法，其特征在于：采用猪圆环病毒2型体外感染猪肺泡巨噬细胞系3D4/2细胞。

【技术特征摘要】
1.一种体外感染猪圆环病毒2型建立猪肺泡巨噬细胞炎症模型的方法，其特征在于：采用猪圆环病毒2型体外感染猪肺泡巨噬细胞系3D4/2细胞。2.根据权利要求1所述的体外感染猪圆环病毒2型建立猪肺泡巨噬细胞炎症模型的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)3D4/2细胞经复苏传代后，细胞计数仪计数活细胞数＞95％，调整细胞浓度备用；(2)设置细胞对照组和不同浓度PCV2病毒感染组，加入DMEM培养液及相应浓度病毒液，与细胞吸附2h后弃液，加入1mL含5％FBS的DMEM培养液后继续培养，分别于第4、8、12、24、48h收样，用于细胞活性及与细胞分泌炎性相关因子指标的测定。3.根据权利要求1所述的体外感染猪圆环病毒2型建立猪肺泡巨噬细胞炎症模型的方法，其特征在于步骤(1)按以下操作进行：3D4/2细胞复苏后，用含10％-FBS-DMEM培养液转入瓶中，于37℃、5％CO2培养箱中培养，待细胞长至70％-80％时进行传代，传代时用0.25％胰酶消化后以1∶2或者1∶3的比例进行传代培养，细胞计数仪计数活细胞数＞95％，调整细胞浓度为1×106cell/mL备用。4.根据权利要求1所述的体外感染猪圆环...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡庭俊，宋漫玲，韦英益，施君，谢小东，安慧青，朱瑜，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：广西,45