一种间充质干细胞的无血清培养基制造技术

本发明专利技术涉及干细胞领域，公开了一种间充质干细胞的培养基及其大规模培养方法。本发明专利技术所述间充质干细胞的培养基，包括无血清培养基、碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、血小板衍生因子PDGF、转化生长因子–β、转铁蛋白、L‑谷氨酞胺、黄芪多糖、维生素、胰岛素、氢化可的松、纤连蛋白和亚油酸。本发明专利技术所述培养基不含有FBS，降低细胞污染的几率，同时对MSC的扩增起到促进作用。采用本发明专利技术所述培养基对间充质干细胞进行大规模培养可获得大量高纯度间充质干细胞，且能保持间充质干细胞良好的干细胞特性，适用于所有类型MSC的大规模培养。

【技术实现步骤摘要】
一种间充质干细胞的无血清培养基
本专利技术涉及干细胞领域，具体涉及一种间充质干细胞的无血清培养基。
技术介绍
间充质干细胞(MSC,mesenchymalstemcells)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层，属于多能干细胞，MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。如间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。目前间充质干细胞临床应用于解决多种血液系统疾病，心血管疾病，肝硬化，神经系统疾病，膝关节半月板部分切除损伤修复，自身免疫性疾病等方面取得了重大突破，挽救了更多病患的生命。此外，间充质干细胞在神经系统修复及更多方面具有长远的发展前景。大量研究证实，成体中的间充质干细胞会随着年龄的增加，含量也会逐渐降低，而且增殖和分化的能力也会相应的下降。因此需要对分离得到的原代间充质干细胞进行大规模培养高效扩增，以克服间充质干细胞细胞数量少的技术问题。目前，在间充质干细胞的常规培养中，最常见的培养体系是采用DMEM/F12培养基加上体积比为10％的胎牛血清(FBS)进行间充质干细胞的体外培养与扩增。虽然FBS可为间充质干细胞提供必要的营养物质，但FBS属于动物源性物质，成分比较复杂，在临床应用上存在潜在的风险，也增加了细胞污染的几率。而且FBS是一种价格比较高的生物制品，在间充质干细胞的大规模培养中，会增加生产的成本。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种间充质干细胞的培养基，不含有FBS，降低细胞污染的几率，同时对MSC的扩增起到促进作用。为了实现本专利技术的目的，本专利技术采用如下技术方案：一种间充质干细胞的培养基，包括无血清培养基、碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、血小板衍生因子PDGF、转化生长因子–β、转铁蛋白、L-谷氨酞胺、黄芪多糖、维生素、胰岛素、氢化可的松、纤连蛋白和亚油酸。本专利技术所述间充质干细胞的培养基在无血清培养基的基础上添加碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、血小板衍生因子PDGF、转化生长因子-β、转铁蛋白、L-谷氨酞胺、黄芪多糖、维生素、胰岛素、氢化可的松、纤连蛋白和亚油酸，不含有FBS，降低细胞污染的几率，同时对MSC的扩增起到促进作用，同时保持原有的间充质干细胞特性。其中，作为优选，所述间充质干细胞的培养基中所述无血清培养基为lonzaUltraCULTUREMEDIUM无血清培养基。作为优选，所述间充质干细胞的培养基中所述碱性成纤维细胞生长因子浓度为1-100ng/mL，所述表皮细胞生长因子浓度为5-20ng/mL，所述血小板衍生因子PDGF浓度为5-10μg/L，所述转化生长因子-β浓度为1-100ng/mL，所述转铁蛋白浓度为5-20mg/L，所述L-谷氨酞胺浓度为1-5mM，所述黄芪多糖浓度为40-80mg/L，所述维生素浓度为50-100mg/L，所述胰岛素浓度为1-10U/ml，所述氢化可的松浓度为5-20mg/L，所述纤连蛋白浓度为5-50mg/L、亚油酸2-10mg/L。在一些优选实施方案中，所述碱性成纤维细胞生长因子浓度为50ng/mL。在一些优选实施方案中，所述表皮细胞生长因子浓度为5ng/mL。在一些优选实施方案中，所述血小板衍生因子浓度为5ng/mL。在一些优选实施方案中，所述转化生长因子-β浓度为20ng/mL。在一些优选实施方案中，所述转铁蛋白浓度为10mg/L。在一些优选实施方案中，所述L-谷氨酞胺浓度为2mM。在一些优选实施方案中，所述黄芪多糖浓度为50mg/L。在一些优选实施方案中，所述维生素为水溶性维生素，更优选为维生素C。所述维生素浓度优选为60mg/L。在一些优选实施方案中，所述胰岛素浓度为5U/ml。在一些优选实施方案中，所述氢化可的松浓度为10mg/L。在一些优选实施方案中，所述纤连蛋白浓度为20mg/L。在一些优选实施方案中，所述亚油酸5mg/L。本专利技术还提供了一种间充质干细胞的大规模培养方法，取P1代间充质干细胞接种上述间充质干细胞的培养基，置于5％CO2、37℃培养箱培养，当细胞融合度达到80％～90％后传代。本专利技术所述间充质干细胞的大规模培养方法，适用于所有类型MSC的大规模培养，所述间充质干细胞可以为骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、牙髓间充质干细胞或外周血间充质干细胞。作为优选，所述接种密度为1×105/mL-2×106/mLP1代间充质干细胞。更优选为5×105/mL。在一些实施方案中，所述P1代间充质干细胞的原代分离培养方法具体为组织块剪碎，加入完全培养基，于37℃，5％CO2静止培养，期间补加完全培养基，待组织块有细胞爬出后去掉组织块，清洗后加入完全培养基继续培养，当细胞融合度达到80％～90％后，去掉细胞培养上清，清洗后加入含胰蛋白酶消化液消化，完全培养基终止消化，离心，弃上清，用完全培养基重悬。在一些实施方案中，所述P1代间充质干细胞的原代分离培养方法中所述含胰蛋白酶消化液中胰蛋白酶浓度为0.25v/v％，所含EDTA浓度为0.04v/v％。在一些实施方案中，所述P1代间充质干细胞的原代分离培养方法中所述原代分离培养方法中消化液消化的时间为1-2min。在一些实施方案中，所述P1代间充质干细胞的原代分离培养方法中所述间充质干细胞来源与脐带组织。所述脐带可以取自产后弃置的脐带组织，采用含有双抗的PBS保存。所述含有双抗的PBS为含青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲液，其中青霉素工作浓度为100U/mL，链霉素工作浓度为0.1mg/mL。在一些实施方案中，所述培养前完全培养基的加入量为0.07mL/cm2-0.1mL/cm2。在一些优选实施方案中，在培养期间需要补加完全培养基直至组织块有细胞爬出。在一些具体实施例中，所述培养期间补加完全培养基的加入量为0.07mL/cm2-0.1mL/cm2。本专利技术所述P1代间充质干细胞的原代分离培养方法中，在组织块有细胞爬出后去掉组织块，并对细胞进行清洗。所述清洗可以采用PBS清洗。本专利技术所述P1代间充质干细胞的原代分离培养方法中，在清洗后加入完全培养基继续培养，至细胞融合度达到80％～90％。在一些实施方案中，所述清洗后完全培养基的加入量为0.15mL/cm2-0.21mL/cm2。在一些实施方案中，本专利技术所述P1代间充质干细胞的原代分离培养方法中，所述终止消化的完全培养基的加入量为消化液体积的5倍～10倍。在一些实施方案中，本专利技术所述P1代间充质干细胞的原代分离培养方法中所述离心为200g-400g离心5min。在一个具体实施例中，考察本专利技术所述间充质干细胞的大规模培养方法培养的间充质干细胞的增殖能力，由细胞生长曲线图可知本专利技术所述间充质干细胞的大规模培养方法培养的间充质干细胞0～2天为适应期，3～6天为对数生长期，细胞增殖较快，第7天细胞增殖变慢，进入了平台期。表明本专利技术所述间充质干细胞的大规模培养方法培养的间充质干细胞的增殖能力较强。进一步的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种间充质干细胞的培养基，包括无血清培养基、碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、血小板衍生因子PDGF、转化生长因子–β、转铁蛋白、L‑谷氨酞胺、黄芪多糖、维生素、胰岛素、氢化可的松、纤连蛋白和亚油酸。

【技术特征摘要】
1.一种间充质干细胞的培养基，包括无血清培养基、碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、血小板衍生因子PDGF、转化生长因子–β、转铁蛋白、L-谷氨酞胺、黄芪多糖、维生素、胰岛素、氢化可的松、纤连蛋白和亚油酸。2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述无血清培养基为lonzaUltraCULTUREMEDIUM无血清培养基。3.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述碱性成纤维细胞生长因子浓度为1-100ng/mL，所述表皮细胞生长因子浓度为5-20ng/mL，所述血小板衍生因子PDGF浓度为5-10μg/L，所述转化生长因子-β浓度为1-100ng/mL，所述转铁蛋白浓度为5-20mg/L，所述L-谷氨酞胺浓度为1-5mM，所述黄芪多糖浓度为40-80mg/L，所述维生素浓度为50-100mg/L，所述胰岛素浓度为1-10U/ml，所述氢化可的松浓度为5-20mg/L，所述纤连蛋白浓度为5-50mg/L、所述亚油酸2-10mg/L。4.一种间充质干细胞的大规模培养方法，取P1代间充质干细胞接种权利要求1所述间充质干细胞的培养基，置于...

【专利技术属性】
技术研发人员：李首一，石晓川，
申请(专利权)人：吉林省太阳鸟再生医学工程有限责任公司，
类型：发明
国别省市：吉林,22