一种毛囊干细胞储存液及其制备方法和应用技术

本发明专利技术具体公开了一种毛囊干细胞储存液及其制备方法和应用，所述储存液包括DMEM/F12、NaHC03、表皮生长因子(EGF)、类胰岛素生长因子‑I(IGF‑I)、氢化可的松、胎牛血清(FBS)，头孢菌素，腺嘌呤、碱性成纤维细胞生长因子。本发明专利技术的毛囊干细胞储存液在利用利用贴壁法分离毛囊外根鞘细胞，在完全培养液中，4‑5天便可见毛囊外根鞘边缘向外游离生长出单个细胞，培养一周左右即可明显看到大量细胞从外根鞘边缘生长出来，其中混杂有上皮样形态细胞毛囊细胞分离培养与鉴定及毛囊体外重塑研究和成纤维形态细胞；随着游离生长细胞的增多，生长速率逐渐加快，在第15天左右时，细胞进入对数生长期。

【技术实现步骤摘要】
一种毛囊干细胞储存液及其制备方法和应用
本专利技术涉及干细胞
，具体地，涉及一种毛囊干细胞储存液及其制备方法和应用。
技术介绍
毛囊(hairfollicle)是表皮向真皮凹陷后形成的能控制毛发生长的皮肤附属结构，是由胚胎期神经外胚层与问充质相互作用，最终发育形成的由多层细胞组成的、具有合成多种特异角质蛋白功能的复杂的动态器官。在哺乳动物的一生中，毛囊反复周期性地经历着生长期、退行期和休止期的变化，并通过周期性的生长，显示出完全的自我再生能力。毛囊的发育、分化与再生是一系列真皮细胞与上皮细胞相互作用的结果。其中，毛乳头细胞(dermalpapillacell，DPC)与外根鞘细胞(outerrootsheathcell，ORSC)作为重要的毛囊真皮与上皮细胞，二者的相互作用及其所涉及的细胞因子和受体，形成固有的信号通路。因此，在毛发的生长分化、再生、损伤、毛囊修复、初级毛囊和次级毛囊发育等生理过程中发挥着重要作用。毛囊是一个复杂的皮肤衍生结构，虽然相关研究在体外诱导取得了一些进展，但准确的说还是毛囊样细胞结构，不是真正的毛囊。因此目前现有的体外模型还未能诱导出具备完整生理功能的毛囊，也不适宜作为模拟胚胎期毛囊发育与分化和研究毛囊生长周期信号调控的通用体外生物模型。
技术实现思路
针对现有技术的上述不足，本专利技术提供一种毛囊干细胞储存液及其制备方法和应用，以解决上述的技术问题。本专利技术是通过以上技术方案予以实现的：一种毛囊干细胞储存液，所述储存液包括DMEM/F12、NaHC03、表皮生长因子(EGF)、类胰岛素生长因子-I(IGF-I)、氢化可的松、胎牛血清(FBS)，头孢菌素，腺嘌呤、碱性成纤维细胞生长因子；所述储存液中以DMEM培养液和F12培养液为基础液，DMEM培养液与F12培养液的比例为3-6:1，NaHC03的浓度为3mg/mL～10mg/mL，表皮生长因子(EGF)的浓度为5ng/mL～20ng/mL，类胰岛素生长因子-I(IGF-I)的浓度为15ng/mL～50ng/mL，氢化可的松的浓度为200ng/L～300ng/L，胎牛血清的体积百分比为1％-10％，头孢菌素的浓度为20ng/mL～50ng/mL，腺嘌呤的浓度为30μg/mL～80μg/mL，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为8ng/mL～20ng/mL。更优选地，所述DMEM培养液与F12培养液的比例为3-5:1，NaHC03的浓度为3mg/mL～8mg/mL，表皮生长因子(EGF)的浓度为5ng/mL～15ng/mL，类胰岛素生长因子-I(IGF-I)的浓度为15ng/mL～30ng/mL，氢化可的松的浓度为200ng/L～250ng/L，胎牛血清的体积百分比为1％-6％，头孢菌素的浓度为20ng/mL～40ng/mL，腺嘌呤的浓度为30μg/mL～60μg/mL，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为8ng/mL～15ng/mL。更优选地，所述DMEM培养液与F12培养液的比例为3:1，NaHC03的浓度为5mg/mL，表皮生长因子(EGF)的浓度为10ng/mL，类胰岛素生长因子-I(IGF-I)的浓度为20ng/mL，氢化可的松的浓度为220ng/L，胎牛血清的体积百分比为5％，头孢菌素的浓度为30ng/mL，腺嘌呤的浓度为50μg/mL，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为10ng/mL。一种利用以上所述的储存液培养毛囊干细胞的方法，包括以下步骤：S1在无菌环境下，将分离得到的毛囊用PBS冲洗3-5次，均匀涂布于培养皿中，使用移液器缓慢滴加0.2％的蛋白酶K至刚刚没过游离的毛囊，并将培养皿盖好置于37℃，80rpm的摇床中，孵育5-20min；S2.利用移液器将残留的消化液吸出，立刻加入少量的权利要求1的储存液，至浸润状态，置于37℃，70rpm的摇床中，孵育60-120min，促进细胞贴壁；S3.待细胞贴壁后，再加入少量储存液，置于37℃，CO2浓度含量为5％，湿度为60-80％的环境中进行培养，观察并记录细胞分离生长情况；S4.待毛囊周围迁移出大量上皮样细胞后，更换为每孔3mL工作培养液，放入37℃，5％C02，湿度为60-80％的培养箱中启动ORSC原代培养；S5.倒置显微镜下观察，游离出的毛囊外根鞘细胞(ORSC)生长成单层后，消化移入培养瓶中使用工作培养液继续进行培养，2～3天更换一次工作培养液培养液。相对于现有技术，本专利技术的有益效果：本专利技术的毛囊干细胞储存液在利用利用贴壁法分离毛囊外根鞘细胞，在完全培养液中，4～5天便可见毛囊外根鞘边缘向外游离生长出单个细胞，培养一周左右即可明显看到大量细胞从外根鞘边缘生长出来，其中混杂有上皮样形态细胞(细胞呈圆形，随后伸展成多角形，似鹅卵石状)毛囊细胞分离培养与鉴定及毛囊体外重塑研究和成纤维形态细胞；随着游离生长细胞的增多，生长速率逐渐加快，在第15天左右时，细胞进入对数生长期。此时完全培养液更换为工作培养液，上皮样形态细胞(ORSC)依然保持快速的生长速率和旺盛的增殖活性，而成纤维形态细胞生长受到明显抑制，随着传代培养的进行，上皮样形态细胞(ORSC)形成优势细胞群，在倒置相差显微镜下观察，可见毛囊外根鞘细胞排列紧密规则，细胞饱满，透明度高，胞核圆形，胞质较少。当细胞传至5代以上时，其增殖活性开始降低，个别细胞出现空泡化、凋亡等现象，此时将工作培养液更换为维持培养液，ORSC逐渐恢复良好的生长与增殖活力，随后多数细胞向四周呈克隆状生长，胞体延长，向外伸出2～4个片足，形成致密单层后细胞由上皮样形态变化为短梭状平行排列。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。实施例1一种毛囊干细胞储存液，所述储存液包括DMEM/F12、NaHC03、表皮生长因子(EGF)、类胰岛素生长因子-I(IGF-I)、氢化可的松、胎牛血清(FBS)，头孢菌素，腺嘌呤、碱性成纤维细胞生长因子；所述储存液中以DMEM培养液和F12培养液为基础液，DMEM培养液与F12培养液的比例为3-6:1，NaHC03的浓度为3mg/mL～10mg/mL，表皮生长因子(EGF)的浓度为5ng/mL～20ng/mL，类胰岛素生长因子-I(IGF-I)的浓度为15ng/mL～50ng/mL，氢化可的松的浓度为200ng/L～300ng/L，胎牛血清的体积百分比为1％-10％，头孢菌素的浓度为20ng/mL～50ng/mL，腺嘌呤的浓度为30μg/mL～80μg/mL，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为8ng/mL～20ng/mL。实施例2一种利用以上所述的储存液培养毛囊干细胞的方法，包括以下步骤：S1在无菌环境下，将分离得到的毛囊用PBS冲洗3-5次，均匀涂布于培养皿中，使用移液器缓慢滴加0.2％的蛋白酶K至刚刚没过游离的毛囊，并将培养皿盖好置于37℃，80rpm的摇床中，孵育5-20min；S2.利用移液器将残留的消化液吸出，立刻加入少量的权利要求1的储存液，至浸润状态，置于37℃，70rpm的摇床中，孵育60-120min，促进细胞贴本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种毛囊干细胞储存液，其特征在于，所述储存液包括DMEM/F12、NaHC03、表皮生长因子(EGF)、类胰岛素生长因子‑I(IGF‑I)、氢化可的松、胎牛血清(FBS)，头孢菌素，腺嘌呤、碱性成纤维细胞生长因子；所述储存液中以DMEM培养液和F12培养液为基础液，DMEM培养液与F12培养液的比例为3‑6:1，NaHC03的浓度为3mg/mL～10mg/mL，表皮生长因子(EGF)的浓度为5ng/mL～20ng/mL，类胰岛素生长因子‑I(IGF‑I)的浓度为15ng/mL～50ng/mL，氢化可的松的浓度为200ng/L～300ng/L，胎牛血清的体积百分比为1％‑10％，头孢菌素的浓度为20ng/mL～50ng/mL，腺嘌呤的浓度为30μg/mL～80μg/mL，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为8ng/mL～20ng/mL。

【技术特征摘要】
1.一种毛囊干细胞储存液，其特征在于，所述储存液包括DMEM/F12、NaHC03、表皮生长因子(EGF)、类胰岛素生长因子-I(IGF-I)、氢化可的松、胎牛血清(FBS)，头孢菌素，腺嘌呤、碱性成纤维细胞生长因子；所述储存液中以DMEM培养液和F12培养液为基础液，DMEM培养液与F12培养液的比例为3-6:1，NaHC03的浓度为3mg/mL～10mg/mL，表皮生长因子(EGF)的浓度为5ng/mL～20ng/mL，类胰岛素生长因子-I(IGF-I)的浓度为15ng/mL～50ng/mL，氢化可的松的浓度为200ng/L～300ng/L，胎牛血清的体积百分比为1％-10％，头孢菌素的浓度为20ng/mL～50ng/mL，腺嘌呤的浓度为30μg/mL～80μg/mL，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为8ng/mL～20ng/mL。2.根据权利要求1所述的毛囊干细胞储存液，其特征在于，所述DMEM培养液与F12培养液的比例为3-5:1，NaHC03的浓度为3mg/mL～8mg/mL，表皮生长因子(EGF)的浓度为5ng/mL～15ng/mL，类胰岛素生长因子-I(IGF-I)的浓度为15ng/mL～30ng/mL，氢化可的松的浓度为200ng/L～250ng/L，胎牛血清的体积百分比为1％-6％，头孢菌素的浓度为20ng/mL～40ng/mL，腺嘌呤的浓度为30μg/mL～60μg/mL，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为8ng/mL～15ng/mL。3...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐智峰，张新，
申请(专利权)人：广州沙艾生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44