制备犬胎膜间充质干细胞的方法和犬胎膜间充质干细胞技术

本发明专利技术涉及制备犬胎膜间充质干细胞的方法和犬胎膜间充质干细胞。具体涉及用于犬胎膜间充质干细胞的细胞冻存液，制备犬胎膜间充质干细胞的方法包括以下步骤：消毒和清洗、消化处理、细胞培养、细胞传代、细胞冻存。本发明专利技术从犬胎膜制备间充质干细胞的方法呈现优异的技术效果，并且所用的培养基能够大大提高制备干细胞的效率。所制得的间充质干细胞能够有益的治疗犬科动物的关节炎、骨折、肌肉损伤、韧带损伤、软骨损伤、关节损伤、认知功能障碍、免疫介导性疾病、干眼症、复发性葡萄膜炎、肝脏疾病、心脏病、肾脏疾病、糖尿病、胃肠道疾病、甲状腺疾病、皮肤病。

【技术实现步骤摘要】
制备犬胎膜间充质干细胞的方法和犬胎膜间充质干细胞
本专利技术属于犬科动物疾病的干细胞治疗
，涉及从犬的胎膜中制备间充质干细胞的方法，以及这种间充质干细胞在治疗犬科动物疾病中的用途。本专利技术从犬胎膜制备间充质干细胞的方法呈现优异的技术效果。所制得的间充质干细胞能够有益的治疗犬科动物的关节炎、骨折、肌肉损伤、韧带损伤、软骨损伤、关节损伤、认知功能障碍、免疫介导性疾病、干眼症、复发性葡萄膜炎、肝脏疾病、心脏病、肾脏疾病、糖尿病、胃肠道疾病、甲状腺疾病、皮肤病。进一步的，本专利技术还涉及对所述从犬的胎膜制备的间充质干细胞进行冻存的方法。本专利技术另外还涉及在制备犬胎膜间充质干细胞的过程中使用的培养基，这种培养基为高效获得间充质干细胞提供了可能。本专利技术另外还涉及在一种犬胎膜间充质干细胞的冻存液。
技术介绍
间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs或MSC)是存在于机体间质组织中的成体干细胞，可以从胎盘、脐带、胎膜、骨髓、脂肪组织等多种来源获取。MSC具有很强的自我增殖能力和多向分化潜能。在可控条件下，它能在体内或体外分化成如神经细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞和成骨细胞等多种类型的细胞。同时MSC还具有免疫兼容性，不会造成免疫排斥反应，可进行同种异体移植。另外MSC还不具有致瘤性，但可支持造血，并能分泌多种有益细胞因子和免疫因子，因此可安全地用于组织再生和修复治疗，在传统医疗手段束手无策的疑难杂症方面显示出了巨大的治疗潜能。在兽医领域，干细胞疗法能有效地提高动物的生活质量，帮助它们摆脱病痛的困扰。其中犬不仅是重要的伴侣动物，也可经训练成为搜救犬、导盲犬等工作犬，另外它也是新药评估以及临床前药物试验的重要动物模型。目前，在犬干细胞治疗方面，已经有诸多通过间充质干细胞注射成功治疗犬关节炎，骨折、肌肉、韧带或软骨/关节损伤的案例。其它诸如犬类认知功能障碍、免疫介导性疾病、干眼症、复发性葡萄膜炎、各类肝脏疾病、心脏病、肾脏疾病、糖尿病、胃肠道疾病、甲状腺问题、皮肤病等方面的治疗也正在评估中。巨大的应用前景迫切需要建立高效的犬科动物间充质干细胞分离制备方法，以规模化地分离出高质量MSC。目前犬上常用的MSC来源为脂肪和骨髓，但从这两种来源获取干细胞的过程不可避免地会给供体动物带来创伤和痛苦，而尽管胎盘/脐带、胎膜属于动物生产时的废弃物，但它们也是MSC丰富的来源之一，因此通过它们作为样本分离细胞可以更好地保护动物。目前从犬的器官/组织，特别是从犬的胎膜，分离制备间充质干细胞的方法有限，且有其局限性。尽管从人类相关组织、器官中分离干细胞已有众多方法报道，例如本申请人研发团队的中国专利技术专利公开号CN102660501A(中国专利申请号201210159918.1)公开了一种分离和扩增脐带新鲜组织间充质干细胞的方法，然而，可能是由于物种差异的原因，本专利技术的专利技术人已经发现，上述专利文献的方法并不适合直接用于犬科动物。因此，本领域迫切期待有新的方法来从犬的胎膜分离制备间充质干细胞的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种从犬的胎膜制备间充质干细胞的方法，已经出人意料地发现，使用本专利技术方法从犬的胎膜制备间充质干细胞，呈现令人鼓舞的效果，本专利技术基于此发现而得以完成。为此，本专利技术第一方面提供了从犬的胎膜制备间充质干细胞的方法和/或冻存方法，该方法包括以下步骤：(1)消毒和清洗：从胎盘样品采集盒中取出胎盘，置于不锈钢杯中，依次使用酒精(例如75％酒精，酒精浸泡消毒时间为10～60s，优选30s)以及生理盐水反复漂洗表面，对胎盘进行消毒处理；接着用手术镊慢慢撕取胎膜，并置于玻璃皿中，剔除血管后，使用磷酸缓冲液(例如pH6.5的0.025M磷酸二氢钠缓冲液))再次冲洗，去除表面污血、杂质；(本步骤通常是在生物安全柜内进行处理)(2)消化处理：将步骤(1)得到的胎膜组织(在另一个细胞培养平皿内)剪成组织块(例如，组织块的大小约为0.05-0.5立方厘米，优选约为0.05-0.2立方厘米，优选约0.1立方厘米的立方形块状)，将组织块放入消化酶溶液(例如其包含I型胶原酶、DMEM-F12，例如照如下方法配制：将0.1g的I型胶原酶加入100ml的DMEM-F12，然后用0.45μm过滤器过滤得到消化液)中，消化处理0.5-3小时(例如，37℃消化处理1-2小时，例如1.5小时)，过滤清除组织块(例如，是通过滤网进行的，所述滤网为50-150μm滤网，优选约100μm滤网)后，加入间充质干细胞培养基以终止消化，然后对消化得到的细胞进行细胞清洗，最终获得细胞悬液；(如未另外说明，本专利技术所用的间充质干细胞培养基中含有15重量份的FBS、1重量份的L-Glutamine、0.05重量份的Gentamicin和84重量份的DMEM-F12)(3)细胞培养：将步骤(2)得到的细胞悬液放入培养容器(例如，以密度0.2-2×104/cm2加入培养容器中，优选以密度约1×104/cm2加入)，再将培养容器放进培养箱中进行培养，培养至第2-7天(例如第3-6天，例如第4天，例如第5天)时将培养容器从培养箱中取出，补加适量(例如3ml)间充质干细胞培养基，继续培养；在第8-11天(例如第9天)时将培养容器从培养箱中取出，进行第一次全换液，继续培养；往后每1-3天(例如2天)进行一次全换液；(4)细胞传代：当培养容器中的贴壁细胞融合率达到40％-70％(例如60％)以后，利用消化酶(例如，在本专利技术中，如未特别说明，使用TrypLETMExpress)将贴壁细胞脱离容器底部，离心，抽走上清液，加入充质干细胞培养基重新悬浮细胞，再接种于培养容器进行培养，此后每1-3天(例如每2天)换液一次，直至融合率达到70-90％(例如80％)后，即得P1代胎膜间充质干细胞；接着照上述培养方法进行必要的传代(例如，本专利技术所用的TrypLETMExpress，其组成为：氯化钾200.0mg/L、磷酸二氢钾200.0mg/L、氯化钠8000.0mg/L、七水磷酸氢二钠2160.0mg/L、EDTA457.6mg/L、商品化量的rProtease；该TrypLETMExpress可以商业途径购自赛默飞世尔公司，其相关技术信息例如参见http://www.thermofisher.com/cn/zh/home/technical-resources/media-formulation.346.html)；任选的(5)冻存：将步骤(4)所得胎膜间充质干细胞中添加细胞冻存液(例如以体积比1:1的量加入)于液氮中冷冻，备用。(例如，所述细胞冻存液包含DMEM-F12、二甲基亚砜和人血白蛋白。在一个实施方案中，该细胞冻存液包含约65份的DMEM-F12、约10份的二甲基亚砜、约15份的人血白蛋白。根据本专利技术第一方面的方法，步骤(1)中所述PBS缓冲液是磷酸的钠盐和/或钾盐配制的，其pH为5.0-8.0，优选pH为5.5-76，优选pH为6.0-7.0。在一个实施方案中，所述PBS缓冲液中磷酸根的浓度为0.01-0.5M，优选0.02-0.1M。在本专利技术下文试验中，如未特别说明，所用PBS缓冲液是磷酸钠盐，其中磷酸根的浓度为0.025M，pH为6.5。需要说明的是，本专利技术人发本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于犬胎膜间充质干细胞的细胞冻存液，其中包含约65份的DMEM‑F12、约10份的二甲基亚砜、约15份的人血白蛋白、0.2～0.5％w/v特别是0.25％w/v右旋糖苷‑40。

【技术特征摘要】
1.用于犬胎膜间充质干细胞的细胞冻存液，其中包含约65份的DMEM-F12、约10份的二甲基亚砜、约15份的人血白蛋白、0.2～0.5％w/v特别是0.25％w/v右旋糖苷-40。2.一种犬胎膜间充质干细胞，其细胞纯度大于90％；该犬胎膜间充质干细胞是照包括以下步骤的方法制备得到的：(1)消毒和清洗：将胎盘依次使用酒精以及生理盐水反复漂洗表面，对胎盘进行消毒处理；接着撕取胎膜，剔除血管后，使用磷酸缓冲液再次冲洗，去除表面污血、杂质；(2)消化处理：将步骤(1)得到的胎膜组织剪成组织块，将组织块放入消化酶溶液中，消化处理0.5-3小时，过滤清除组织块后，加入间充质干细胞培养基以终止消化，然后对消化得到的细胞进行细胞清洗，最终获得细胞悬液；(3)细胞培养：将步骤(2)得到的细胞悬液放入培养容器(例如，以密度0.2-2×104/cm2加入培养容器中，优选以密度约1×104/cm2加入)，再将培养容器放进培养箱中进行培养，培养至第2-7天(例如第3-6天，例如第4天，例如第5天)时将培养容器从培养箱中取出，补加适量(例如3ml)间充质干细胞培养基，继续培养；在第8-11天(例如第9天)时将培养容器从培养箱中取出，进行第一次全换液，继续培养；往后每1-3天(例如2天)进行一次全换液；(4)细胞传代：当培养容器中的贴壁细胞融合率达到40％-70％(例如60％)以后，利用消化酶(例如，在本发明中，如未特别说明，使用TrypLETMExpress)将贴壁细胞脱离容器底部，离心，抽走上清液，加入充质干细胞培养基重新悬浮细胞，再接种于培养容器进行培养，此后每1-3天(例如每2天)换液一次，直至融合率达到70-90％(例如80％)后，即得P1代胎膜间充质干细胞；接着照上述培养方法进行必要的传代(例如，本发明所用的TrypLETMExpress，其组成为：氯化钾200.0mg/L、磷酸二氢钾200.0mg/L、氯化钠8000.0mg/L、七水磷酸氢二钠2160.0mg/L、EDTA457.6mg/L、商品化量的rProtease；该TrypLETMExpress可以商业途径购自赛默飞世尔公司，其相关技术信息例如参见http://www.thermofisher.com/cn/zh/home/technical-resources/media-formulation.346.html)；任选的(5)冻存：将步骤(4)所得胎膜间充质干细胞中添加细胞冻存液(例如以体积比1:1的量加入)于液氮中冷冻，备用。3.从犬的胎膜制备间充质干细胞的方法和/或冻存方法，该方法包括以下步骤：(1)消毒和清洗：将胎盘依次使用酒精以及生理盐水反复漂洗表面，对胎盘进行消毒处理；接着撕取胎膜，剔除血管后，使用磷酸缓冲液再次冲洗，去除表面污血、杂质；(2)消化处理：将步骤(1)得到的胎膜组织剪成组织块，将组织块放入消化酶溶液中，消化处理0.5-3小时，过滤清除组织块后，加入间充质干细胞培养基以终止消化，然后对消化得到的细胞进行细胞清洗，最终获得细胞悬液；(3)细胞培养：将步骤(2)得到的细胞悬液放入培养容器(例如，以密度0.2-2×104/cm2加入培养容器中，优选以密度约1×104/cm2加入)，再将培养容器放进培养箱中进行培养，培养至第2-7天(例如第3-6天，例如第4天，例如第5天)时将培养容器从培养箱中取出，补加适量(例如3ml)间充质干细胞培养基，继续培养；在第8-11天(例如第9天)...

【专利技术属性】
技术研发人员：王小武，迟大明，朱春颖，郭春明，许晓椿，
申请(专利权)人：天津博雅秀岩生物技术有限公司，威海北大博雅物种多样性研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12