一种人肌母细胞外泌体的制备方法、产品及其应用技术

本发明专利技术属于皮肤细胞损伤修护技术领域，更具体地，涉及一种人肌母细胞外泌体的制备方法、产品及其应用。通过在特定的温度以及分离条件下，采用多阶段递增离心的方式执行3次以上的离心去除沉淀，直至获得所需的人肌肉细胞外泌体产品，制备方法简单易行。本发明专利技术提供的人肌母细胞外泌体来源于人肌母细胞，含有脂质、蛋白质、mRNA及miRNA等多种生物活性物质，对皮肤日常维护和损伤具有明显促修复作用，肌母细胞外泌体制作成冻干粉，便于储存和运输，亦可制作成各种护肤品或药物制剂使用，为人肌母细胞外泌体对皮肤保养和皮肤损伤修复提供可能。

【技术实现步骤摘要】
一种人肌母细胞外泌体的制备方法、产品及其应用
本专利技术属于皮肤细胞损伤修护
，更具体地，涉及一种人肌母细胞外泌体的制备方法、产品及其应用。
技术介绍
皮肤老化和皮肤粘膜损伤在日常生活极为常见，创面可大可小，可深可浅，损伤部位各不相同。目前大面积的皮肤损伤治疗主要通过全身支持治疗、创面的清理及结痂切除和外科植皮等方法，传统的治疗方法虽然有一定效果但存在皮源紧张、易感染和巨大疤痕形成等问题。近年来，细胞治疗皮肤粘膜损伤的医学研究得到广泛关注，特别是干细胞可以通过分化为皮肤细胞、汗腺细胞和旁分泌促进皮肤创伤的修复，在皮肤粘膜损伤修复中具有临床应用前景。然而，干细胞植入体内后定向分化仍有许多问题需要解决，长期应用安全性(如癌变、骨化等)问题不容乐观，而且活细胞的使用存在储存和运输困难等问题，因此寻找能够替代干细胞在组织损伤修复中起作用的细胞制品或细胞因子显得十分迫切。外泌体最早发现于体外培养的绵羊红细胞上清液中，是细胞主动分泌的直径在40-100nm，密度在1.10-1.18g/ml的囊泡小体。不同细胞分泌的外泌体具有不同的组成成分和功能，因此外泌体在多种疾病中扮演生物标志物的角色。目前将外泌体应用于损伤修复领域，主要来源为各种干细胞。例如通过体内外实验发现，在二级烧烫伤动物模型中，人脐带间充质干细胞外泌体(hucMSC-Ex)能够增强伤口处的血管再生和修复，这一效果是通过Wnt4/β-Catenin途径实现的(StemCellsTranslMed.2015,4(5):513-522.)。随后该团队进一步报道，人类脐带间充质干细胞外泌体中14-3-3zeta可介导YAP和P-LATS结合形成一个复合物促进YAP的磷酸化，与皮肤再生过程中外泌体Wnt4信号通路相互协作，hucMSC-Ex不仅可作为Wnt/β-catenin信号的“加速器”以促进受损皮肤组织的再生修复，而且可通过调节YAP控制皮肤再生作为该信号的“刹车”(StemCells.2016,34(10):2485-2500)。然而，作为仅有的外泌体来源的干细胞外泌体产量很低，而大面积烧烫伤临床用药需求大，因此亟需寻找到新的外泌体细胞来源。另一方面，目前人们多采用超速离心、免疫磁珠、超滤和试剂盒等方法实现外泌体的提取分离。超速离心法是最常用的外泌体分离手段，使用低速离心和高速离心交替进行的方法，可分离到大小相近的囊泡颗粒。超速离心法因操作简单，获得的囊泡数量较多且不会影响外泌体的粒径而广受欢迎。但是超速离心法耗时长，回收率不好控制，另外操作不当还会导致得到的外泌体纯度受到影响，离心条件控制不当，重复离心操作也会对囊泡造成一定程度的损伤，降低获得的囊泡质量。
技术实现思路
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本专利技术提供了一种人肌母细胞外泌体的制备方法及其应用，其充分结合外泌体在皮肤损伤修护应用中的特点和需求，针对性对外泌体的提取源、提取方法进行重新设计，相应获得了一种提取纯度高、质量好的人肌母细胞外泌体提取方法，而且将该肌母细胞外泌体用于皮肤损伤修复时取得了良好的效果，由此解决了现有高速离心法提取外泌体时由于离心条件控制不当造成的外泌体纯度以及质量受到影响，以及现有的干细胞体外培养产量低，不能满足应用需求的技术问题。为实现上述目的，按照本专利技术的一个方面，提供了一种人肌母细胞外泌体的制备方法，其特征在于，该方法采用人肌母细胞作为外泌体的来源，将人肌母细胞分化培养的上清液通过递增离心的方式执行3次以上的多步离心分离操作，直至获得所需的外泌体产品。优选地，对于所述多步离心分离操作而言，其优选采用以下过程来实现：S10、在0℃～4℃的温度下，将人肌母细胞分化培养的上清液在300g～3000g的离心力条件下离心10min～30min，去除沉淀并收集获得第一上清液A；S20、在保持恒温的情况下，将该第一上清液A在10000g～12000g的离心力条件下继续离心60min～200min，去除沉淀并收集获得第二上清液B；S30、在保持恒温的情况下，将该第二上清液B在100000g～120000g的离心力条件下继续离心120min以上，然后收集沉淀且将其作为最终制备的人肌母细胞外泌体产品。优选地，所述的制备方法，还包括步骤：S40、将所述人肌母细胞外泌体制成冻干粉，然后将所述冻干粉制成人肌母细胞外泌体制剂，所述制剂优选为片剂、颗粒剂、胶囊剂、喷雾剂、溶液剂、浸膏剂或软膏剂。优选地，对于所述多步离心分离操作而言，其进一步优选采用以下过程来实现：S101、在0℃～4℃的温度下，将人肌母细胞分化培养的上清液首先在300g～500g的第一离心力下离心5min～30min，去除沉淀并收集获得上清液A1；S102、接着将该上清液A1在2000g～3000g的第二离心力下离心10min～40min，去除沉淀并收集获得所述第一上清液A；S201、在保持恒温的情况下，将该上清液A在10000g～12000g的第三离心力条件下继续离心60min～100min，去除沉淀并收集获得上清液B1；S202、接着在保持温度和第三离心力条件不变的情况下，对该上清液B1继续离心60min～100min，去除沉淀并收集获得所述第二上清液B；S301、在保持恒温的情况下，首先将该第二上清液B采用孔径为0.22μm以下的无菌滤膜执行过滤；S302、接着在保持恒温的条件下，将执行过滤后的所述第二上清液B继续在100000g～120000g的第四离心力条件下离心60min～120min，弃上清液，收集沉淀；S303、向步骤S302所述沉淀加入PBS重混后，接着在保持温度和第四离心力条件不变的情况下，离心60min～120min，弃上清液，最后收集沉淀且将其作为最终制备的人肌母细胞外泌体产品。按照本专利技术的另一个方面，提供了一种护肤产品，该护肤产品的主要组分为人肌母细胞外泌体，所述人肌母细胞外泌体通过对皮肤细胞促增值和抑凋亡，用于皮肤细胞的修复和/或更新。按照本专利技术的另一个方面，提供了一种药品，其特征在于，该药品的主要组分为人肌母细胞外泌体，所述人肌母细胞外泌体用于优选烫伤创面之类的皮肤粘膜创面的抗菌消炎、促进创面愈合和/或疤痕修复。优选地，所述人肌母细胞外泌体通过以下机理实现皮肤粘膜创面愈合和/或疤痕修复愈合：促进创面组织完成表皮再生，促进新生血管和细胞的再生，优化皮肤组织胶原的产生，从而而减少瘢痕的形成。按照本专利技术的另一个方面，提供了一种人肌母细胞外泌体的制备方法，该制备方法包括下列步骤：(1)肌母细胞培养将人肌母细胞置于盛有37℃±1℃的温水的无菌离心管中，加入5mL-7mL完全培养基，混匀后1000rpm-1500rpm离心2-4min，离心结束后在底部细胞部分加入4mL-6mL完全培养基，将混匀好的细胞转移至37℃±1℃、4％-6％CO2培养箱中，第二天更换培养基；(2)肌母细胞传代待细胞密度达到75％时进行传代，加入PBS洗掉残存的完全培养基，随后加入0.4-0.6mLEDTA胰蛋白酶，将细胞转移至培养箱中消化2-3min，严格控制消化时间后迅速加入4-6mL完全培养基终止消化，将肌母细胞从壁上吹下来后转移到无菌离心管中，1000-1500rpm离心2-4min，结束后按十分之一的比例传代；(3)本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人肌母细胞外泌体的制备方法，其特征在于，该方法采用人肌母细胞作为外泌体的来源，将人肌母细胞分化培养的上清液通过递增离心的方式执行3次以上的多步离心分离操作，直至获得所需的外泌体产品。

【技术特征摘要】
1.一种人肌母细胞外泌体的制备方法，其特征在于，该方法采用人肌母细胞作为外泌体的来源，将人肌母细胞分化培养的上清液通过递增离心的方式执行3次以上的多步离心分离操作，直至获得所需的外泌体产品。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，对于所述多步离心分离操作而言，其优选采用以下过程来实现：S10、在0℃～4℃的温度下，将人肌母细胞分化培养的上清液在300g～3000g的离心力条件下离心10min～30min，去除沉淀并收集获得第一上清液A；S20、在保持恒温的情况下，将该第一上清液A在10000g～12000g的离心力条件下继续离心60min～200min，去除沉淀并收集获得第二上清液B；S30、在保持恒温的情况下，将该第二上清液B在100000g～120000g的离心力条件下继续离心120min以上，然后收集沉淀且将其作为最终制备的人肌母细胞外泌体产品。3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，对于所述多步离心分离操作而言，其进一步优选采用以下过程来实现：S101、在0℃～4℃的温度下，将人肌母细胞分化培养的上清液首先在300g～500g的第一离心力下离心5min～30min，去除沉淀并收集获得上清液A1；S102、接着将该上清液A1在2000g～3000g的第二离心力下离心10min～40min，去除沉淀并收集获得所述第一上清液A；S201、在保持恒温的情况下，将该上清液A在10000g～12000g的第三离心力条件下继续离心60min～100min，去除沉淀并收集获得上清液B1；S202、接着在保持温度和第三离心力条件不变的情况下，对该上清液B1继续离心60min～100min，去除沉淀并收集获得所述第二上清液B；S301、在保持恒温的情况下，首先将该第二上清液B采用孔径为0.22μm以下的无菌滤膜执行过滤；S302、接着在保持恒温的条件下，将执行过滤后的所述第二上清液B继续在100000g～120000g的第四离心力条件下离心60min～120min，弃上清液，收集沉淀；S303、向步骤S302...

【专利技术属性】
技术研发人员：敖明章，余龙江，谭强，刘伟图，
申请(专利权)人：华中科技大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42