CDC42信号通路在激活原始卵泡生长发育中的应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，公开了CDC42信号通路在激活原始卵泡生长发育中的应用。本发明专利技术采用CDC42通路抑制剂以及过表达载体证实了快速激活CDC42可激活原始卵泡，并促进其发育，为原始卵泡激活和发育提供了一种全新的信号通路，可将CDC42激活剂以及CDC42过表达载体应用在激活原始卵泡生长发育试剂中和/或在体外以非治疗目的激活原始卵泡生长中。

【技术实现步骤摘要】
CDC42信号通路在激活原始卵泡生长发育中的应用
本专利技术涉及生物
，特别涉及CDC42信号通路在激活原始卵泡生长发育中的应用。
技术介绍
哺乳动物卵巢是包括人类女性在内的雌性动物生殖繁衍所必须的生殖器官，卵巢主要具有两个功能：支持卵母细胞发育成熟和产生女性激素。从出生到发育期、育龄期，最后到围绝经期和老年期，卵巢经历了一系列变化，这些变化直接影响生殖功能、性特征及心理。而在女性生殖细胞发育过程中，原始卵泡又是卵巢最基本的功能单位。原始卵泡由单个休眠的卵母细胞及包裹在其周围的一层扁平前颗粒细胞共同构成。原始卵泡的数量即原始卵泡库在哺乳动物出生前后确定下来，其初始数量是在早期发育阶段被决定并加以固定的，并且成年后原始卵泡库不可更新。在卵巢中，休眠的原始卵泡需要经过一个被称为卵泡激活的过程方可进入后续发育，随后经历初级卵泡、次级卵泡和有腔卵泡的发育阶段，最终排出成熟的卵子，受精后发育为子代个体。因而，原始卵泡的数量决定了雌性哺乳动物卵巢中可利用生殖资源的数量，原始卵泡正常的激活发育则决定了可利用生殖资源的质量。在原始卵泡激活发生后，卵母细胞的体积增长数百倍，周围的颗粒细胞迅速增殖，由最初的单层扁平颗粒细胞发育至数层立方状的上千个细胞。随后当卵泡发育至有腔卵泡阶段，其生长受到垂体分泌的促卵泡激素FSH的刺激进而发育至最终排卵阶段。最终在排卵前促黄体激素LH峰的作用下，卵母细胞排出，颗粒细胞则发生黄体化为受精卵的发育做准备。在哺乳动物的卵巢中，原始卵泡库中的原始卵泡不断被激活而进入生长期，以人为例，女性原始卵泡库建立初期，大约有500万左右的原始卵泡，在正常的成年女性每个月大约有1000个原始卵泡进入生长期，但在女性一生中排出的成熟卵子只有区区数百个，其利用率非常低。而当原始卵泡库中的原始卵泡不足1000个时，卵巢将不再排卵，即此时女性进入绝经期。如果能对卵巢中的原始卵泡加以利用，将会有巨大的应用价值。并且在一些病理条件下，原始卵泡不能正常激活和发育，如原发性卵巢功能不全和卵巢早衰等疾病导致育龄女性不孕不育，因而找到一种有效的调节原始卵泡激活的方法具有重要的意义。现有研究表明PI3K信号通路和mTOR信号通路在原始卵泡的激活中扮演着重要的角色。现有的原始卵泡激活剂为PI3K信号通路激活剂、PTEN抑制剂和mTOR信号通路激活剂，但这些试剂激活原始卵泡需要时间较长，致使病人多次手术增加痛苦。都需将皮质块取出，体外冷冻保存，当病人恢复一段时间后，将取出的皮质块进行体外激活处理后移植回病人体内，原始卵泡逐级发育为成熟卵子后取出卵子，体外受精后移植回病人体内进行后续发育。同时，目前常用的PI3K信号通路激活剂或mTORC1信号通路激活剂，普遍为化学合成分子，并且由于PI3K信号通路激活剂或mTORC1信号通路与癌症具有直接关系，其安全性有待进一步评估。因而，找到一种可快速激活原始卵泡的生物天然试剂和一种新的激活方法来避免病人遭受多次手术的痛苦有巨大的现实意义。不仅可以为不孕不育的女性患者提供多种治疗方案，减少手术给患者带来的伤害；并降低处理后的潜在并发症产生。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供CDC42信号通路在激活原始卵泡生长发育中的应用，通过快速激活或过表达CDC42进而高效激活原始卵泡生长发育；本专利技术的另外一个专利技术目的在于提供CDC42激活剂在体外以非治疗诊断目的激活原始卵泡生长发育的应用，以及在制备体内或体外激活原始卵泡生长发育的试剂中的应用；本专利技术的另外一个目的在于提供一种具体的体内或体外激活原始卵泡生长发育的试剂；本专利技术的另外一个目的在于提供过表达CDC42载体在体外以非治疗诊断目的激活原始卵泡生长发育的应用，以及在制备体内或体外激活原始卵泡生长发育的试剂中的应用。本专利技术采用CDC42通路抑制剂ML141(Sigma公司)和ZCL278(Selleck公司)处理小鼠卵巢并继续培养，然后将卵巢固定并进行组织学检测，结果显示，CDC42通路抑制剂的处理可导致原始卵泡的激活显著抑制，卵巢中CDC42活性显著下降，卵泡计数结果表明CDC42活性抑制后原始卵泡激活比率明显下调；上述结果预示CDC42通路可能与原始卵泡激活生长有密切联系，因此本专利技术构建CDC42过表达载体并转染至小鼠卵巢中进行过表达处理，免疫印迹检测表明CDC42过表达显著提升了CDC42蛋白在卵巢中的表达量，并且卵泡计数结果表明CDC42过表达处理后原始卵泡激活比率明显上调，同时组织学检测表明CDC42过表达处理后激活卵泡显著增多。上述两方面实验结果证明，CDC42信号通路在激活原始卵泡生长中存在明显直接的正向作用，即可通过快速激活或过表达CDC42进而高效激活原始卵泡生长。基于上述信号通路的研究结论，本专利技术提供了CDC42激活剂在制备激活原始卵泡生长试剂中的应用和/或在体外以非治疗目的激活原始卵泡生长的应用。其中，本专利技术所提出的在体外以非治疗目的激活原始卵泡生长的应用是为了进一步研究卵泡后续的生长发育过程，用于基础研究所用，同时由于在体外研究，无法达到治疗目的。由于CDC42信号通路在激活原始卵泡生长中作用的确立，则所有本领域已知的CDC42激活剂都可快速激活CDC42并进一步激活原始卵泡生长，而在本专利技术具体实施方式中，本专利技术通过CN02(Cytoskeleton公司)和EGF(Sigma公司)两种具体的激活剂进行了验证实验。应用CDC42通路激活剂在体外处理小鼠卵巢组织，发现生长卵泡比原始卵泡的比率显著大于对照组，且原始卵泡卵母细胞激活后下游标志分子FOXO3a出核，卵母细胞活化关键通路PI3K下游标志分子FOXO3a和AKT的磷酸化明显上调，表明原始卵泡激活比率明显提升。而在体内处理小鼠卵巢组织，发现卵巢含有更多的生长卵泡，初级卵泡所占的比例明显高于对照组，且体内处理试剂和方式对小鼠无不良影响，并具有促进雌性小鼠生育的作用。根据上述技术效果，本专利技术对应提出了一种激活原始卵泡生长的试剂，包括CDC42激活剂，所述CDC42激活剂的浓度为50-200ng/ml，优选为100ng/ml。在体外处理的激活试剂中，除核心的CDC42激活剂外还包括激活细胞培养液和/或其他已公开的原始卵泡激活药物；在本专利技术具体实施方式中，所述激活细胞培养液为DMEM/F12培养液，其可优选加入ITS和抗生素，抗生素可选择青霉素和链霉素。更为具体地，所述试剂以DMEM/F12为母液，内含100倍的ITS、10Units/ml青霉素和10□g/ml链霉素，以及50-200ng/ml的CDC42激活剂；在体内处理的激活试剂中，除核心的CDC42激活剂外还包括生物水溶胶和/或其他原始卵泡激活药物，其中生物水溶胶可选择为透明质酸凝胶，更具体地为基质水溶胶matrigel或宫腔用交联透明质酸凝胶。基于前述信号通路的研究结论，本专利技术另一方面还提供了CDC42过表达载体在制备激活原始卵泡生长试剂中的应用和/或在体外以非治疗目的激活原始卵泡生长的应用。其中的在体外以非治疗目的激活原始卵泡生长的应用仍是为了进一步研究卵泡后续的生长发育过程，用于基础研究所用，同时由于在体外研究，无法达到治疗目的。作为优选，所述CDC42过表达载体以市售的可过表达载体为基础，通过基因工本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.CDC42激活剂在制备激活原始卵泡生长发育试剂中的应用和/或在体外以非治疗目的激活原始卵泡生长发育的应用。

【技术特征摘要】
1.CDC42激活剂在制备激活原始卵泡生长发育试剂中的应用和/或在体外以非治疗目的激活原始卵泡生长发育的应用。2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述CDC42激活剂为CN02或EGF。3.一种激活原始卵泡生长发育的试剂，其特征在于，包括CDC42激活剂。4.根据权利要求3所述试剂，其特征在于，还包括激活细胞培养液和/或其他原始卵泡激活药物。5.根据权利要求4所述试剂，其特征在于，所述激活细胞培养液为DMEM/F12培养液。6.根据权利要求5所述试剂，其特征在于，所述DMEM/F12培养液含有ITS和抗生素。7.根据权利要求3所述试剂，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：张华，张佳伟，颜昊，夏国良，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11