一种胎盘间充质干细胞诱导分化形成胰岛β细胞的方法技术

技术编号:19447940 阅读:52 留言:0更新日期:2018-11-14 17:06
本发明专利技术公开了一种胎盘间充质干细胞诱导分化形成胰岛β细胞的方法,属于细胞培养技术领域。无菌条件下胎盘组织块,剪碎,平铺到培养瓶中,用无血清培养基进行培养,至细胞密度为1‑2x10

【技术实现步骤摘要】
一种胎盘间充质干细胞诱导分化形成胰岛β细胞的方法
本专利技术涉及胎盘间充质干细胞诱导分化形成胰岛β细胞的方法,属于细胞培养

技术介绍
糖尿病,是一种严重危害人类健康的常见疾病,其发病机制尚不明确,目前也没有有效的防治方法。据估计,目前全世界约有糖尿病人1.7亿。我国糖尿病发病率一直呈现上升趋势,在成年人群当中,2010年患病人数高达2400万,成为发病率仅次于印度的糖尿病第二大国同时,糖尿病病死率仅次于心脑血管性疾病和癌症,已成为人类的第三大疾病。糖尿病的蔓延给社会及家庭造成了沉重的经济负担,所以糖尿病的防治刻不容缓。Ⅰ型及Ⅱ型糖尿病晚期需要每日注射胰岛素,但这种烦琐而昂贵的替代治疗并不能精确地调节血糖,最终会导致胰岛素抵抗和各种并发症的发生。虽然胰岛细胞移植给治愈糖尿病带来了希望,但面临着两大挑战。可供移植的细胞来源严重匾乏以及异体免疫排斥反应。胰岛细胞属于终末分化细胞,体外培养难以存活和增殖,所以寻找新的胰岛细胞来源成了世界关注的焦点。干细胞可以诱导分化为胰岛样细胞,再将这些诱导的细胞移植到糖尿病患者体内,从而发挥调节血糖的功能。干细胞具有强大的增殖及分化潜能,如果在一定条件下能将其诱导分化为胰岛素分泌细胞,无疑可极大地解决胰岛细胞来源不足的问题因此,干细胞诱导分化为胰岛样细胞是对治疗研究的近期方向之一,其技术的突破意味着的治疗将从控制血糖水平转入根本治愈的阶段,具有重大的理论价值和临床应用前景。间充质干细胞作为糖尿病干细胞治疗的种子细胞具有很大的优势:来源广泛,易于分离培养,具有巨大的体外扩增潜能,具有独特的免疫学特征,易于基因修饰,可作为细胞载体,具备了作为细胞移植治疗优良种子细胞所必备的必要条件。目前尚未找到直接注射人源MSCs到糖尿病小鼠体内进行研究的报道。但科学工作者发现,将转染了绿色荧光蛋白基因的小鼠骨髓干细胞注射糖尿病小鼠体内,在胰岛中发现了GFP阳性的胰岛素分泌细胞,同时该实验排除了细胞融合的可能,说明骨髓干细胞在体内适当的微环境刺激下可以自发分化为胰岛素分泌细胞。但在105个受体小鼠胰岛细胞中,仅发现5个阳性的细胞,占移植的骨髓细胞的比例很小,说明移植体内后自发转化为胰岛素分泌细胞的效率极低,难以发挥治疗作用。由于直接移植到体内,其自发分化的效率很低,人们考虑先在体外诱导MSCs分化为胰岛素分泌细胞,再移植到体内发挥治疗作用。科学家从成人骨髓中分离出MSCs,先用碱性成纤维生长因子(b-FGF,basicfibroblastgrowthfactor),表皮生长因子(EGF,epidermalgrowthfactor)等诱导MSCs分化,然后用高糖培养基和β细胞调节素、尼克酞胺等诱导MSCs向胰岛β细胞样分化。经检测,该方案诱导的胰岛样细胞团表达胰岛素和胰高血糖素等激素;双硫腙染色阳性。虽然上述成体MSCs在体外确实能分化为胰岛样细胞,但都存在诱导时间长,诱导方案复杂、胰岛素分泌量低、体内作用小等不足。而胎盘来源的MSCs无论是数量还是增殖分化能力都远远强于成体,我们将胎盘来源的MSCs诱导分化胰岛β细胞,证实该细胞具有更强的胰岛素释放能力,这也为Ⅰ型糖尿病患者治疗带来了新的希望。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供高纯度,有活性胰岛β细胞制备方法,此种方法能辅助Ⅰ型糖尿病治疗。为实现上述目的,本专利技术提供如下技术方案:一种胎盘间充质干细胞诱导分化形成胰岛β细胞的方法具体步骤为:步骤一:获得高质量的胎盘间充质细胞;1-1.选取足月顺产或剖宫产的盘状胎盘,确保无胎粪等污染,剪取胎盘底蜕膜面的组织,将底蜕膜面的细胞即靠近母体面的表层减去,减去之后挑颜色鲜红的组织剪取;1-2.将剪取的组织块在含有庆大霉素的生理盐水中清洗至鲜红色,其中500mL的生理盐水中含2支庆大霉素,庆大霉素的规格为8万单位/支;1-3.挑取颜色鲜亮的组织,将组织放入10cm皿中,倾斜平皿,使组织位于高处,便于水分去除,剪成肉泥,注意无菌操作;1-4.将剪碎的组织用细胞刮刀平铺于T75cm2细胞培养瓶中,做好标记;1-5.将细胞培养瓶倒扣,有组织块的血培养面位于上方,缓慢加入6mL无血清培养基,培养基位于下方,培养基选用-XF人间充质干细胞基础培养基及添加物,产品号分别是:10151A,10151B;两者以10:1混合;混合后加入L-gln,使其终浓度达到2mM;放入37℃培养箱中,5%CO2,放置2h,拧紧瓶盖,所述的细胞培养瓶为有通气滤膜的细胞培养瓶;1-6.将培养瓶正置,此时应确保培养液能覆盖住每块组织,静置培养;1-7.三天后观察组织块,注意动作要轻,尽量不要晃动;1-8.七天后再半量换液,一般7天能爬出细胞,此后均半量换液;1-9.待细胞汇合度达到80%左右时,进行传代培养;1-10.将培养液去除,用6mL生理盐水冲洗一遍,加入2mL0.25%Trypsin-EDTA(1X),放入37℃培养箱中,约3-5min,待细胞变圆时,停止消化,吸取消化液到含有3ml培养基的离心管里,加入6mL-XF人间充质干细胞基础培养基及添加物至培养瓶终止消化,轻轻吹打贴壁的细胞,使细胞均匀分布于溶液中,吸取细胞到新的离心管中,1500rpm,离心5min;1-11.弃去上层溶液,收集细胞,加入传代培养基,传代培养基中完全培养基-XF:MSCGM-CDTMBulletKit=3:1,按着1×105个/mL细胞量进行传代培养;1-12.待细胞生长至80-90%密度时,收获细胞;步骤二、间充质干细胞向胰岛β细胞诱导分化;2-1.对增殖能力较强的MSCs,传代到P3-P4代时用预诱导液,其中培养基选用L-DMEM培养基,含5%FCS,20μMLY294002,10mMβ-Me,抑制其增殖,待其达到90%以上汇合时,用体积浓度为0.25%的胰酶消化细胞,按照1:1或者1:2的比例接种于26cm2低粘附性的培养瓶中;2-2.每瓶中加入5ml诱导液,诱导液为MDM培养液,含10ng/mLb-FGF,10ng/mLEGF,以及1%-2%FCS,持续诱导6-12天;2-3.对悬浮或半悬浮的诱导分化的胰岛样细胞团,通过离心的方法换培养基;2-4.对增殖能力一般的MSCs,可以省略预诱导阶段,待传代细胞到90%,直接用诱导液进行诱导。与现有技术相比,本专利技术的有益效果如下:它能克服现有技术的弊端。具有取材容易、少量胎盘即可获取大量具有活性的MSCs细胞、通过体外诱导分化形成胰岛β细胞。本方法适宜大规模培养,对机体损伤小,无免疫排斥等优点,并且它取材来源广泛,体内储备量大,适宜机体治疗。它的培养过程较为简单,操作容易,适合Ⅰ型糖尿病治疗的辅助治疗中。具体实施方式下面对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本专利技术保护的范围。实施例1:一种胎盘间充质干细胞诱导分化形成胰岛β细胞的方法具体步骤为:步骤一:获得高质量的胎盘间充质细胞;1-1.选取足月顺产或剖宫产的盘状胎盘,确保无胎粪等污染,剪取胎盘底蜕膜面的组织,将底蜕膜面的细胞即靠近母体面的表层减去,减去之后挑颜色鲜红的组织剪本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种胎盘间充质干细胞诱导分化形成胰岛β细胞的方法,其特征在于:具体步骤为:步骤一:获得高质量的胎盘间充质细胞;(1‑1).选取足月顺产或剖宫产的盘状胎盘,确保无胎粪等污染,剪取胎盘底蜕膜面的组织,将底蜕膜面的细胞即靠近母体面的表层减去,减去之后挑颜色鲜红的组织剪取;(1‑2).将剪取的组织块在含有庆大霉素的生理盐水中清洗至鲜红色,其中500mL的生理盐水中含2支庆大霉素,庆大霉素的规格为8万单位/支;(1‑3).挑取颜色鲜亮的组织,将组织放入10cm皿中,倾斜平皿,使组织位于高处,便于水分去除,剪成肉泥,注意无菌操作;(1‑4).将剪碎的组织用细胞刮刀平铺于T75cm2细胞培养瓶中,做好标记;(1‑5).将细胞培养瓶倒扣,有组织块的血培养面位于上方,缓慢加入6mL无血清培养基,培养基位于下方,培养基选用

【技术特征摘要】
1.一种胎盘间充质干细胞诱导分化形成胰岛β细胞的方法,其特征在于:具体步骤为:步骤一:获得高质量的胎盘间充质细胞;(1-1).选取足月顺产或剖宫产的盘状胎盘,确保无胎粪等污染,剪取胎盘底蜕膜面的组织,将底蜕膜面的细胞即靠近母体面的表层减去,减去之后挑颜色鲜红的组织剪取;(1-2).将剪取的组织块在含有庆大霉素的生理盐水中清洗至鲜红色,其中500mL的生理盐水中含2支庆大霉素,庆大霉素的规格为8万单位/支;(1-3).挑取颜色鲜亮的组织,将组织放入10cm皿中,倾斜平皿,使组织位于高处,便于水分去除,剪成肉泥,注意无菌操作;(1-4).将剪碎的组织用细胞刮刀平铺于T75cm2细胞培养瓶中,做好标记;(1-5).将细胞培养瓶倒扣,有组织块的血培养面位于上方,缓慢加入6mL无血清培养基,培养基位于下方,培养基选用人间充质干细胞基础培养基及添加物,产品号分别是:10151A,10151B;两者以10:1混合;混合后加入L-gln,使其终浓度达到2mM;放入37℃培养箱中,5%CO2,放置2h,拧紧瓶盖,所述的细胞培养瓶为有通气滤膜的细胞培养瓶;(1-6).将培养瓶正置,此时应确保培养液能覆盖住每块组织,静置培养;(1-7).三天后观察组织块,注意动作要轻,尽量不要晃动;(1-8).七天后再半量换液,一般7天能爬出细胞,此后均半量换液;(1-9).待细胞汇合度达到80%左右时,进行传代培养;(1-10).将培养液去...

【专利技术属性】
技术研发人员:汪晓敏袁卫平万谦
申请(专利权)人:溯源生命科技股份有限公司
类型:发明
国别省市:北京,11

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