本发明专利技术提供一种用于皮肤瘢痕修复的成纤维细胞的制备方法,其中,所述方法包括从组织中提取成纤维细胞,通过含成纤维生长因子、维生素E、磷酸‑3‑O‑芸香糖苷和L‑乳酸培养获得成纤维细胞,制备的成纤维细胞具有良好的生物学活性,修复断裂纤维组织,恢复皮肤基底层的胶原蛋白结构,同时抑制胶原蛋白过度表达造成的纤维化和瘢痕形成;本发明专利技术提供的成纤维细胞将对皮肤瘢痕具有很好治疗和美容效果。
【技术实现步骤摘要】
用于皮肤瘢痕修复的成纤维细胞的制备方法及其产品
本专利技术涉及一种用于皮肤瘢痕修复的成纤维细胞的方法以及通过所述方法获得治疗皮肤瘢痕的成纤维细胞,特别地,本专利技术涉及从组织中通过体外培养获得成纤维细胞,具有修复断裂纤维组织,恢复皮肤基底层的胶原蛋白结构;同时抑制胶原蛋白过度表达造成的纤维化和瘢痕形成,将有望对皮肤瘢痕达到更佳的治疗和美容效果。
技术介绍
皮肤瘢痕为各种创伤后所引起的正常皮肤组织的外观形态和组织病理学改变,肉芽组织经改建成熟形成的纤维结缔组织。皮肤损伤后机体组织过度增生、结缔组织轻度增生或结缔组织轻度增生原因造成的瘢痕形成。目前对于程度比较严重的凹陷性瘢痕、萎缩性瘢痕及增生性瘢痕,手术切除是主要手段,但任何手术方式都不能将瘢痕完全去除,只是最大限度的改善或矫正瘢痕造成的危害,且手术后还宜形成新的瘢痕。对于程度较轻的瘢痕患者,激光、冷冻或放射治疗是比较常用的手段,效果比较好,但易出现色素沉着和并发症的问题。生物技术的发展也为皮肤瘢痕治疗提供了新的手段,如研究发现胸腺素β4在瘢痕疙瘩组织中表达减少,可以用来作为其的治疗药物;含活性因子的疤痕修复凝胶具有抗纤维母细胞增生、抗炎症和软化、瘢痕组织的作用,以及玛卡祛疤精华胶和含一些活性因子的玛卡祛疤精华素均有着阻止受损皮肤色素产生变异,恢复皮肤的正常肤色和弹性。这些手段均对皮肤瘢痕治疗起着很好的效果。但针对皮肤瘢痕形成的真正原因,抑制胶原蛋白过度表达和皮肤纤维化,是治疗其关键的问题。本专利技术利用成纤维细胞为蛋白表达载体及其本身的功能,对皮肤瘢痕治疗有着很好的效果。成纤维细胞(Fibroblast,FB)已经用于临床治疗领域,在皮肤整形治疗中取得了很好的疗效,已不存在的免疫排斥、伦理学及致瘤性等方面的限制,具有良好的临床应用前景。因而,本专利技术利用体外培养技术获得成纤维细胞,具有修复断裂纤维组织,恢复皮肤基底层的胶原蛋白结构;同时抑制胶原蛋白过度表达造成的纤维化和瘢痕形成,并无成瘤性,有望对皮肤瘢痕修复和美容产生更好的效果。
技术实现思路
本申请人经过研究发现,作为在皮肤瘢痕形成过程中胶原的合成和降解失调,胶原过度沉积的结果;以致胶原蛋白过量表达,创伤皮肤纤维化和瘢痕形成。本专利技术利用成纤维细胞增殖分化和“归巢”的特性,自体成纤维细胞可以修复断裂纤维组织,恢复皮肤基底层的胶原蛋白结构;同时其分泌细胞因子将抑制胶原蛋白表达和纤维化的生物学作用及其成纤维细胞本身的功能,改善皮肤局部微环境,本专利技术专利技术人意外发现通过添加了磷酸-3-O-芸香糖苷和L-乳酸培养对成纤维细胞增殖能力具有很好提升,同时也大大抑制转化生长因子(transforminggrowthfactor-β,TGF-β)的表达,其与瘢痕过度形成关系最密切,从而成纤维细胞在瘢痕组织中进入受损成纤维细胞中,抑制胶原蛋白表达以及瘢痕过度形成,对病理性瘢痕形成的抑制产生了显著的效果。本专利技术提供了一种用于皮肤瘢痕修复的成纤维细胞的制备方法,其特征在于,所述方法包括组织提取的成纤维细胞,通过含成纤维生长因子、维生素E、磷酸-3-O-芸香糖苷和L-乳酸的培养条件下,提高成纤维细胞发挥更佳的抑制胶原蛋白表达过度表达、阻止成纤维细胞纤维化和改善断裂纤维组织修复,能用于治疗皮肤瘢痕。所述的成纤维细胞经免疫荧光技术检测,其标志物α平滑肌肌动蛋白、I型前胶原蛋白α1和III型前胶原蛋白α1表达90%以上。所述FBs具有如下性能:抑制瘢痕组织成纤维细胞胶原蛋白过度表达和纤维化,抑制炎症反应,修复断裂纤维组织,恢复皮肤基底层的胶原蛋白结构;且无瘤性。本专利技术所述的用于皮肤瘢痕修复的成纤维细胞,可以体外传代培养,即FBs通过无血清培养液(1-500ng/ml成纤维生长因子、1-200ng/ml维生素E、0.1-500μg/ml磷酸-3-O-芸香糖苷、1-500μg/mlL-乳酸和1×无血清添加物)体外传代培养,当细胞培养到第5-6天,细胞生长融合达到90%以上,需要使用质量体积比为0.25%的胰酶(含0.05%EDTA)消化传代。取传代培养到3代和10代FBs倒置显微镜下观察的细胞形态,具有相似的细胞形态。所述用于皮肤瘢痕修复的成纤维细胞对外与增生性瘢痕成纤维细胞共培养实验中抑制了增生性瘢痕成纤维细胞增殖和胶原合成,以及α-SMA和I型胶原蛋白表达,促使其凋亡发生;在兔瘢痕模型体内移植实验中,与单独的成纤维细胞移植和生理盐水对照组相比,抑制I型胶原蛋白和TGF-β1基因表达,以及炎症因子的TGF-β1分泌,对皮肤瘢痕具有显著修复;体内体外实验表明均无瘤性。本专利技术还提供一种制备的用于皮肤瘢痕修复的成纤维细胞的试剂盒产品,其特征在于,所述试剂盒包括:1)成纤维细胞无血清培养基;2)II型胶原酶;3)胰酶;4)成纤维生长因子、维生素E、磷酸-3-O-芸香糖苷、L-乳酸;5)无血清添加物;6)使用说明书;本专利技术还提供所述用于皮肤瘢痕修复的成纤维细胞的应用,通过保证了体外培养获得足够数量的成纤维细胞,修复断裂纤维组织,恢复皮肤基底层的胶原蛋白结构的功能,同时发挥其对皮肤瘢痕组织成纤维细胞胶原蛋白过度表达和纤维化,,有望用于治疗皮肤瘢痕。附图说明图1为实施例1制备的人成纤维细胞免疫荧光检测α-SMA、COLIα1和COLIIIα1表达水平图2为实施例1制备的成纤维细胞对增生性瘢痕成纤维细胞增殖水平图图3为实施例1制备的成纤维细胞对增生性瘢痕成纤维细胞胶原合成结果图图4为实施例1方法制备的兔成纤维细胞移植兔耳瘢痕模型血清中TGF-β1分泌水平图具体实施方式本专利技术提供了一种用于皮肤瘢痕修复的成纤维细胞的制备方法,其特征在于,从组织中提取的成纤维细胞,通过含成纤维生长因子、维生素E、磷酸-3-O-芸香糖苷、L-乳酸培养获得成纤维细胞,其可修复断裂纤维组织,恢复皮肤基底层的胶原蛋白结构,同时抑制胶原蛋白过度表达造成的纤维化和瘢痕形成,能用于治疗皮肤瘢痕。本专利技术所述成纤维细胞来源方便,即废弃皮肤、血液和头发毛囊;优选地来源于皮肤。由于成纤维细胞来源方便,细胞培养获得简单,可以从个体化获得能做到个体化应用。本专利技术所述成纤维细胞制备方法,即:废弃皮肤经含2倍青链霉素双抗的1×PBS(pH7.4)洗涤三次后使用1∶1的质量体积比为0.1%的II型胶原酶5-20mL,在4℃冰箱箱中消化过夜;消化后取真皮层组织质量体积比为0.25%胰酶在37℃培养箱中消化4小时,消化后1500rpm离心10分钟,吸弃上清后加入生理盐水重悬,用100μm细胞筛过滤;细胞悬液1000rpm离心10分钟,细胞沉淀用生理盐水重悬洗涤2次后加入完全无血清培养液(含1-500ng/ml成纤维生长因子、1-200ng/ml维生素E、0.1-500μg/ml磷酸-3-O-芸香糖苷、1-500μg/mlL-乳酸和1×无血清添加物)重悬,苔盘兰染色计数后按1-10×106细胞/ml加入到重组人纤连蛋白包被的细胞培养板或培养皿中培养,于37℃,5%CO2培养箱中培养24-72小时;培养24-72小时后用5ml移液管吸弃培养液,加入新鲜无血清培养液进行换液,细胞培养板或培养皿继续放置37℃,5%CO2培养箱中继续培养;当成纤维细胞生长融合达到80%以上时进行消化扩瓶,将培养液吸除,取pH值为7.4的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于皮肤瘢痕修复的成纤维细胞的制备方法,其特征在于,所述方法包括组织中提取成纤维细胞,通过含成纤维生长因子、维生素E、磷酸‑3‑O‑芸香糖苷和L‑乳酸培养获得成纤维细胞。所述的成纤维细胞经免疫荧光技术检测,其标志物α平滑肌肌动蛋白、I型前胶原蛋白α1和III型前胶原蛋白α1表达90%以上。所述成纤维细胞具有如下性能:抑制胶原蛋白过度表达造成的纤维化和瘢痕形成,同时成纤维细胞修复断裂纤维组织,恢复皮肤基底层的胶原蛋白结构;且无瘤性。
【技术特征摘要】
1.一种用于皮肤瘢痕修复的成纤维细胞的制备方法,其特征在于,所述方法包括组织中提取成纤维细胞,通过含成纤维生长因子、维生素E、磷酸-3-O-芸香糖苷和L-乳酸培养获得成纤维细胞。所述的成纤维细胞经免疫荧光技术检测,其标志物α平滑肌肌动蛋白、I型前胶原蛋白α1和III型前胶原蛋白α1表达90%以上。所述成纤维细胞具有如下性能:抑制胶原蛋白过度表达造成的纤维化和瘢痕形成,同时成纤维细胞修复断裂纤维组织,恢复皮肤基底层的胶原蛋白结构;且无瘤性。2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,从组织中提取的成纤维细胞,通过1-500ng/ml成纤维生长因子、1-200ng/ml维生素E、0.1-500μg/ml磷酸-3-O-芸香糖苷和1-500μg/mlL-乳酸的无血清培养基条件下培养获得成纤维细胞。3.根据权利要求1-2任一项所述的方法,其特征在于,制备成纤维细胞的培养条件中,优选地,添加0.1-500μg/ml磷酸-3-O-芸香糖苷和1-500μg/mlL-乳酸。4.根据权利要求1-3所述的方法,其特征在于,制备成纤维细胞的培养条件中,更优选地,添加10-200μg/ml磷酸-3-O-芸香糖苷和10-200μg/mlL-乳酸。5.根据权利要求1-4任一项所述的方法,其特征在于,所述成纤维细胞来源废弃皮肤、血液和头发毛囊;优选地来源于皮肤。6.根据权利要求1-5任一项所述的方法,其特征在于,废弃皮肤经含2倍青链霉素双抗的1×PBS(pH7.4)洗涤三次后使用1∶1的质量体积比为0.1%的II型胶原酶5-20mL,在4℃冰箱箱中消化过夜;消化后取真皮层组织质量体积比为0.25%胰酶在37℃培养箱中消化4小时,消化后1500rpm离心10分钟,吸弃上清后加入生理盐水重悬,用100μm细胞筛过滤;细胞悬液1000rpm离心10分钟,细胞沉淀用生理盐水重悬洗涤2次后加入无血清培养液(含1-500ng/ml成纤维生长因子、1-200ng/ml维生素E、0.1-500μg/ml磷酸-3-O-芸香糖苷、1-500μg/mlL-乳酸和1×无血清添加物)重悬,苔盘兰染色计数后按1-10×106细胞/ml加入到重组人纤连蛋白包被的细胞培养板或培养皿中培养,于37℃,5%CO2培养箱中培养24-72小时;培养24-72小...
【专利技术属性】
技术研发人员:不公告发明人,
申请(专利权)人:深圳市嘉祺生物科技有限公司,
类型:发明
国别省市:广东,44
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