小分子诱导可诱导多能性干细胞分化为睾丸间质细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种小分子诱导可诱导多能性干细胞分化为睾丸间质细胞的方法，包括如下步骤：①获取人源可诱导多能性干细胞；②使用不含有碱性成纤维细胞生长因子的E7培养基对人源可诱导多能性干细胞进行预处理培养；③使用分化培养基并结合小分子诱导剂诱导人源可诱导多能性干细胞进行分化，小分子诱导剂包括有DHH激动剂SAG、22R‑OHC、氯化锂、人血小板衍生生长因子AA、成纤维生长因子2、胰岛素样生长因子1、雄激素、促黄体生成素、视黄醇和八溴环磷酸腺苷；④手工剔除克隆团样杂细胞；⑤剔除杂细胞后剩下的细胞用富集培养基继续培养，富集培养基定期更换，最终获得目标睾丸间质细胞。

【技术实现步骤摘要】
小分子诱导可诱导多能性干细胞分化为睾丸间质细胞的方法
本专利技术涉及一种诱导可诱导多能性干细胞分化为睾丸间质细胞的方法，尤其涉及一种由小分子诱导人源可诱导多能性干细胞分化为睾丸间质细胞的方法。
技术介绍
男性生殖健康离不开生殖系统的功能健全。目前，雄激素缺乏症的治疗方法仅停留在雄激素替代治疗。然而，长期的雄激素治疗会引起肝肾功能损伤、免疫力降低、水钠潴留等并发症，而且不受自身昼夜节律的调控。虽然睾丸间质细胞移植可以避免外源性雄激素替代治疗带来的某些并发症，但是睾丸间质细胞来源不足和异体移植可能导致宿主免疫排斥反应限制了睾丸间质细胞在临床上的应用。目前，诱导全能干细胞或成体干细胞分化为睾丸间质细胞作为供体移植是国际上公认的解决上述问题的突破口。全能干细胞，如胚胎干细胞虽然是一种很好的种子细胞，它理论上能被诱导分化为各种类型的细胞，包括睾丸间质细胞。但是，在临床应用中，胚胎干细胞面临着由于涉及人体胚胎存在伦理学问题，同时也无法克服免疫排斥反应的问题。可诱导多能性干细胞是一种类似于胚胎干细胞的多能性干细胞。可诱导多能性干细胞既具备了胚胎干细胞一样的多能性，同时它可以从任何一种来自患者自体细胞重编程获取，彻底规避了胚胎干细胞应用中所面临的免疫排斥和伦理学问题，具备了巨大的临床应用价值。现有技术中，还未有出现通过小分子将此可诱导多能性干细胞诱导分化为睾丸间质细胞的方法。因此，本专利技术人对此提出了本申请的技术方案。
技术实现思路
本专利技术的目的是诱导可诱导多能性干细胞分化为睾丸间质细胞的方法，尤其是一种由小分子作为诱导剂对可诱导多能性干细胞进行诱导，使之分化为睾丸间质细胞的方法。所述可诱导多能干细胞是指人源可诱导多能性干细胞，具体方法包括如下步骤：①获取人源可诱导多能性干细胞；②使用不含有碱性成纤维细胞生长因子的E7培养基对人源可诱导多能性干细胞进行预处理培养；③使用分化培养基培养并结合小分子诱导剂诱导人源可诱导多能性干细胞进行分化，小分子诱导剂包括有DHH激动剂SAG、22R-OHC、氯化锂、人血小板衍生生长因子AA、成纤维生长因子2、胰岛素样生长因子1、雄激素、促黄体生成素、视黄醇和八溴环磷酸腺苷④手工剔除克隆团杂细胞；⑤剔除所述杂细胞后剩下的细胞用富集培养基继续培养，所述富集培养基定期更换，最终获得目标睾丸间质细胞。为进一步完善上述方案，本专利技术进一步设置为：步骤①中所述人源可诱导多能性干细胞由人源尿液细胞重编程来源的可诱导多能性干细胞经细胞培养获得，具体方法包括如下步骤：将人源尿液细胞重编程来源的可诱导多能性干细胞接种在质量体积比1%基质胶处理过（至少37℃孵育1小时以上）的6孔板上，并置于37℃二氧化碳培养箱内培养，每天全量更换新鲜的E8培养基，发现有分化的细胞及时挑走，每间隔6天传代一次，传代稀释比例为6:1，在每次传代后的第1天，培养基中需要添加10μMY-27632。本专利技术进一步设置为：在获取所述人源可诱导多能性干细胞过程中，为减少对人源可诱导多能性干细胞的损伤，传代时使用质量体积比0.25%EDTA处理3-5分钟，当克隆团边缘部分开始卷起并快脱离培养皿底部时，用去离子的PBS洗1遍，然后用1mL的E8培养基轻轻吹打且吹打次数不超过10次，收集细胞接种到新的被质量体积比1%基质胶预处理过（至少37℃孵育1小时以上）的6孔板上继续培养。本专利技术进一步设置为：定义步骤③中诱导开始时间为第0天，所述小分子诱导剂及其添加时间如下所示：①第0至7天，在分化培养基中加入0.2μmDHH激动剂SAG、5μM22R-OHC和5mM氯化锂;②第7至10天，在分化培养基中加入5ng/mL人血小板衍生生长因子AA和5ng/mL成纤维生长因子2；③第10至17天，在分化培养基中加入5ng/mL人血小板衍生生长因子AA、5nM胰岛素样生长因子1和10μM雄激素；④第17至20天，在分化培养基中加入10ng/mL人血小板衍生生长因子AA和10ng/mL成纤维生长因子2；⑤从第20至25天，在分化培养基中加入5ng/mL促黄体生成素,0.5mM视黄醇和1mM八溴环磷酸腺苷。本专利技术进一步设置为：步骤③中的分化培养基包括有DMEM/F12、体积百分比1%牛血清白蛋白、5mMITS和5ng/mL促黄体生成素。本专利技术进一步设置为：步骤⑤中所述的富集培养基包括有DMEM/HG、体积百分比5%胎牛血清、体积百分比2.5%HS,1×丙酮酸钠、1×GlutaMAX和体积百分比1%P/S。本专利技术进一步设置为：对富集培养基中所培养的目标睾丸间质细胞进行鉴定，鉴定的方法包括免疫荧光鉴定、逆转录PCR检测和蛋白印记检测。本专利技术进一步设置为：步骤②中预培养时间为2天；步骤③中分化培养基每2天更换一次；步骤⑤中富集培养基每2天更换一次。采用这样的方法以后，可以成功将人源可诱导多能性干细胞诱导分化为能分泌睾酮的睾丸间质细胞，从而为未来临床采用患者自体细胞重编程来源的可诱导多能性干细胞分化的睾丸间质细胞，用以进行细胞移植治疗性功能低下等疾病提供细胞来源。采用这样的方法以后，在细胞分化过程未引入外源基因，完全采用小分子诱导，提高了未来临床应用的安全性；小分子诱导过程灵活可控，避免了过度诱导，提高了诱导效率；诱导方法可操作性强，重复性好，可稳定诱导出大量能分泌睾酮的睾丸间质细胞，从而更适用于未来临床应用。以下结合附图对本专利技术进行更进一步详细的说明。附图说明附图1为细胞分化的流程及其结果示意图，其中：图1A为诱导分化示意图，图1B为诱导分化第25天分化组和对照组细胞明场形态，图1C为放射免疫法测定在LH刺激3小时后iPSC（阴性对照），LC（阳性对照）和iPSC-LC（分化组）培养基上清中睾酮水平；附图2为免疫荧光鉴定结果示意图，其中：免疫荧光检测iPSC（阴性对照）、LC（阳性对照）和iPSC-LC（实验组）标记蛋白CYP11A1、HSD3B1、HSD17B3、NANOG和OCT4蛋白表达；附图3为逆转录PCR（RT-PCR）检测结果示意图，其中：图3A为100bpDNAMarker，图3B为RT-PCR检测iPSC（阴性对照）、LC（阳性对照）和iPSC-LC（实验组）基因Lhcgr、Star、Scarb1、Sf-1、Cyp11a1、Hsd3b1、Hsd17b3、Nanog、Oct4、Sox2和Klf4表达；附图4为蛋白印迹检测结果示意图，其中：蛋白印迹检测iPSC（阴性对照）、LC（阳性对照）和iPSC-LC（实验组）标记蛋白LHCGR,SCARB1、SF-1、CYP11A1、HSD3B1、CYP17A1、HSD17B3、NANOG、OCT4、SOX2和SSEA4蛋白表达。具体实施方式本具体实施例仅仅是对本专利技术的解释，其并不是对本专利技术的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本专利技术的权利要求范围内都受到专利法的保护。下面，通过示例性的实施方式对本专利技术具体描述。然而应当理解，在没有进一步叙述的情况下，一个实施方式中的方法和特征也可以有益地结合到其他实施方式中。下文中，睾丸间质细胞简称为LC；胚胎干细胞简称为ESC；人源可诱导多能性干细胞简称为iPSC；由iPSC诱导分化形成的目标睾丸间质细胞简称为iPSC-L本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种小分子诱导可诱导多能性干细胞分化为睾丸间质细胞的方法，其特征在于：所述可诱导多能干细胞是指人源可诱导多能性干细胞，具体方法包括如下步骤：①获取所述人源可诱导多能性干细胞；②使用不含有碱性成纤维细胞生长因子的E7培养基对所述人源可诱导多能性干细胞进行预处理培养；③使用分化培养基并结合小分子诱导剂诱导所述人源可诱导多能性干细胞进行分化，所述小分子诱导剂包括有DHH激动剂、22R‑OHC、氯化锂、人血小板衍生生长因子AA、成纤维生长因子2、胰岛素样生长因子1、雄激素、促黄体生成素、视黄醇和八溴环磷酸腺苷；④手工剔除克隆团样杂细胞；⑤剔除所述杂细胞后将剩下的细胞用富集培养基继续培养，所述富集培养基定期更换,最终获得目标睾丸间质细胞。

【技术特征摘要】
1.一种小分子诱导可诱导多能性干细胞分化为睾丸间质细胞的方法，其特征在于：所述可诱导多能干细胞是指人源可诱导多能性干细胞，具体方法包括如下步骤：①获取所述人源可诱导多能性干细胞；②使用不含有碱性成纤维细胞生长因子的E7培养基对所述人源可诱导多能性干细胞进行预处理培养；③使用分化培养基并结合小分子诱导剂诱导所述人源可诱导多能性干细胞进行分化，所述小分子诱导剂包括有DHH激动剂、22R-OHC、氯化锂、人血小板衍生生长因子AA、成纤维生长因子2、胰岛素样生长因子1、雄激素、促黄体生成素、视黄醇和八溴环磷酸腺苷；④手工剔除克隆团样杂细胞；⑤剔除所述杂细胞后将剩下的细胞用富集培养基继续培养，所述富集培养基定期更换,最终获得目标睾丸间质细胞。2.根据权利要求1所述的小分子诱导可诱导多能性干细胞分化为睾丸间质细胞的方法，其特征在于：步骤①中所述人源可诱导多能性干细胞由人源尿液细胞重编程来源的可诱导多能性干细胞经细胞培养获得，具体方法包括如下步骤：将人源尿液细胞重编程来源的可诱导多能性干细胞接种在质量体积比1%的基质胶处理过（至少37℃孵育1小时以上）的6孔板上，并置于37℃二氧化碳培养箱内培养，每天全量更换新鲜的E8培养基，发现有分化的细胞及时挑走，每间隔6天传代一次，传代稀释比例为6:1，在每次传代后的第1天，培养基中需要添加10μMY-27632。3.根据权利要求1或2所述的小分子诱导可诱导多能性干细胞分化为睾丸间质细胞的方法，其特征在于：在获取所述人源可诱导多能性干细胞过程中，为减少对人源可诱导多能性干细胞的损伤，传代时使用质量体积比0.25%EDTA处理3-5分钟，当克隆团边缘部分开始卷起并快脱离培养皿底部时，用不含Mg2+离子的PBS洗1遍，然后用1mL的E8培养基轻轻吹打且吹打次数不超过10次，收集细胞接种到新的被质量体积比1%基质胶预处理过（至少37℃孵育1小时以上）的6孔板上继续培养。4.根据权利要求1所述的小分子诱导可诱导多能性干细胞分...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭晓令，葛仁山，李超，陈显武，陈勇，李晓珩，
申请(专利权)人：温州医科大学附属第二医院，温州医科大学附属育英儿童医院，
类型：发明
国别省市：浙江,33