一种高含量阿魏酸木贼提取物的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种高含量阿魏酸木贼提取物的制备方法，包括以下步骤：A、挑选颗粒饱满完整、色泽鲜艳有光泽的木贼，消毒后接种于木贼愈伤组织诱导培养基，诱导出木贼愈伤组织；B、制备高产阿魏酸木贼干细胞培养液；C、选取步骤A所得的木贼愈伤组织作为种子，装入高产阿魏酸木贼干细胞培养液中悬浮培养，得木贼干细胞固体粉末；D、将步骤C获得的木贼干细胞固体粉进行破壁处理；E、将步骤D获得的细胞破壁匀浆混合物和无水乙醇按质量比1:（2‑3）混合，过滤，冷冻结晶，分离出柱型结晶，得高含量阿魏酸木贼提取物。本发明专利技术具有所得阿魏酸木贼提取物得率高，阿魏酸木贼提取物中阿魏酸含量高的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种高含量阿魏酸木贼提取物的制备方法
本专利技术涉及植物干细胞培养
，具体涉及一种高含量阿魏酸木贼提取物的制备方法。
技术介绍
阿魏酸在医药，食品，化妆品等领域有着日益广泛的用途。作为药品具有抗炎，止痛，抗血栓形成，抗紫外线辐射，抗自由基以及调节人体免疫功能的作用，调节内分泌、改善微循环和抗疲劳作用。在临床上用于冠心病，脑血管病，脉管炎，白细胞和血小板减少等疾病的治疗。在化妆品中则主要作为抗氧化剂使用，具有吸收紫外线和防止氧化的作用。阿魏酸是科学界公认的美容因子，能改善皮肤质量，使其细腻、光泽、富有弹性。它能防止因日晒而形成的色斑及雀斑，还能抑制自由基的过量产生，改善肤质，调节内分泌，使肌肤细腻光泽，富有弹性。作用机理：通过抑制色素细胞的酪氨酸脢(Tyrosinase)与铜离子反应，来减少黑色素的形成与沉淀。早期，阿魏酸主要是从当归中提取，需要使用大量的有机提取溶剂，而且产物的纯化困难，更重要的是提取效率较低，产量难以满足需求。目前，阿魏酸主要是采取化学合成的方法制备以香兰素和丙二酸为原料通过Knoevenagel反应合成。该路线存在一些缺点：(1)该反应所用的催化剂为吡啶，苯胺等，溶剂和带水剂为甲苯。吡啶具有强烈的恶臭，毒性较大：苯胺具有强烈的致癌作用；甲苯也是易挥发的中强毒性的有机溶剂，不符合绿色化学的要求。(2)反应需要时间，较长，长达几十个小时。(3)反应原料丙二酸昂贵，生产成本较高。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种高含量阿魏酸木贼提取物的制备方法。该方法获得的木贼干细胞固体粉末中阿魏酸木贼提取物含量较高，阿魏酸木贼提取物得率高，阿魏酸木贼提取物中阿魏酸的含量高的优点。解决上述技术问题的具体技术方案如下：一种高含量阿魏酸木贼提取物的制备方法，包括如下步骤：A、挑选新鲜木贼，先流水冲洗1-3遍去除杂质、灰尘后，晾干表面水分，经过体积分数60-80％的乙醇消毒30-35s，然后用0.1％HgCl2溶液消毒5-10min，再用无菌水冲洗5-8次，放在无菌滤纸上晾干；在无菌条件下用剪刀将木贼切成2-5mm小段，接种于木贼愈伤组织诱导培养基上进行诱导培养，得到初级培养木贼愈伤组织；将得到的初级培养木贼愈伤组织再转接至木贼愈伤组织诱导培养基进行继代培养两次，得到增殖后的木贼愈伤组织；B、制备高产阿魏酸木贼干细胞培养液：按质量比称取45-70％MS培养基、10-25％卡拉胶、2.5-5.5％2,4-二氯苯氧乙酸、1.5-4.2％蔗糖、0.05-0.2％3-吲哚丁酸、0.05-0.35％N6-异戊烯基腺嘌呤、0.04-0.1％二氢茉莉酮酸甲酯，在玻璃容器中混合加热至75-82℃，搅拌到完全溶解后冷却到室温，加入适量PBS缓冲液，调节溶液的PH至6.2-6.7；C、选取步骤A所得的木贼愈伤组织作为种子，按接种量为质量比5％的比例,装入含250mL高产阿魏酸木贼干细胞培养液的500mL培养瓶中悬浮培养，摇床转速控制在100-120rpm，培养温度控制在25±1℃，光照控制在1000-1500lx，每天光照8小时，培养10-12天得到乳白色团簇即木贼干细胞，收获乳白色团簇，用去离子水冲洗干净并冷冻干燥得木贼干细胞固体粉末；D、按质量比1:(1-3)将步骤C获得的木贼干细胞固体粉末与丙二醇混合搅拌均匀，使用高压均质机在25000PSI条件下进行破壁匀浆处理；E、将步骤D获得的细胞破壁匀浆混合物和无水乙醇按质量比1:(2-3)混合，依次通过10微米聚丙烯过滤器、医用活性炭过滤器、0.45微米聚丙烯过滤膜进行过滤，获得清液在-10℃冰箱中静置24小时，下层得无色透明柱型结晶，用分液漏斗分出下层柱型结晶，用无水酒精淋洗干净后真空干燥，得高含量阿魏酸木贼提取物。优选的，所述步骤A中木贼愈伤组织诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，并添加蔗糖20-25g/L、琼脂3-6g/L、噻苯隆1.0-3.0g/L、6-苄氨基腺嘌呤1.5-3.5mg/L、a-萘乙酸0.1-0.5mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.01-0.07mg/L，pH值5.8。优选的，所述步骤A中诱导培养的培养条件为：培养温度(25±1)℃、湿度60-70％，先暗培养两周，再光培养20-30天，光培养按光照强度1000lx下16h、暗条件下8h交替进行。优选的，所述步骤A中继代培养的培养条件为：培养温度(25±1)℃、湿度60-70％，先暗培养两周，再光培养55-65天，光培养按光照强度1000lx下16h、暗条件下8h交替进行。本专利技术所得高含量阿魏酸木贼提取物在化妆品中应用，具有祛黑眼圈祛皱保湿功效。本专利技术提供一种眼霜，包括如下重量百分比的组分：上述阿魏酸木贼提取物0.1-5％、霍霍巴(SIMMONDSIACHINENSIS)脂0.1-2％、环五聚二甲基硅氧烷5-15％、环己硅氧烷1-5％、聚二甲基硅氧烷1-5％、聚二甲基硅氧烷醇1-3％、SEPIPLUS2650.3-0.8％、聚二甲基硅氧烷PEG-10/15交联聚合物0.1-2％、丙烯酸(酯)类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物0.1-0.5％、水解透明质酸钠0.01-0.1％、精氨酸0.1-0.5％、焦糖色0.001-0.01％、多元醇5-15％、水余量。在其中一些实施例中，所述多元醇为甘油、山梨醇、1,3-丁二醇中的一种或一种以上的混合。在其中一些实施例中，所述眼霜还可以包括防腐剂，所述防腐剂的添加量为0.1-1％，所述防腐剂为山梨酸钾、苯甲酸钠中的一种。本专利技术所述的SEPIPLUS265是赛比克公司的一款乳化增稠剂。本专利技术具有如下有益效果：本专利技术提供了一种高含量阿魏酸木贼干细胞培养技术，可进行大规模培养获取大量的原材料，采用反相HPLC法测定，阿魏酸木贼提取物的含量可达木贼干细胞干重的9.5-11.5％，阿魏酸木贼提取物得率可达7.5-9.5％，阿魏酸木贼提取物中阿魏酸的含量大于94％。本专利技术制备的高含量阿魏酸木贼提取物可用于制备食品、保健品、化妆品以及药品。本专利技术通过采用特定的高产阿魏酸木贼干细胞培养液，用植物干细胞培养的方法获取富含阿魏酸的木贼干细胞，培养周期短，可进行大规范生产，所得木贼干细胞固体粉末中阿魏酸的含量高；阿魏酸木贼提取物的含量可达木贼干细胞干重的9.5-11.5％，阿魏酸木贼提取物得率可达7.5-9.5％，阿魏酸木贼提取物中阿魏酸的含量大于94％。本专利技术所得高含量阿魏酸木贼提取物应用在化妆品中，具有祛黑眼圈祛皱保湿功效。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施方式作进一步地详细描述，但本专利技术的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数或条件，可参照常规技术进行。本专利技术所述MS培养基采用生产商Sigma-Aldrich，型号M5519。实施例1一种高含量阿魏酸木贼提取物的制备方法，包括如下步骤：A、挑选新鲜木贼，先流水冲洗1遍去除杂质、灰尘后，晾干表面水分，经过体积分数60％的乙醇消毒30s，然后用0.1％HgCl2溶液消毒5min，再用无菌水冲洗8次，放在无菌滤纸上晾干；在无菌条件下用剪刀将木贼切成2mm小段，接种于木贼愈伤组织诱导培养基上进行诱导培养，培养条件为：培养温度(25±1)℃、湿度60％，先暗培养两周，再光培养3本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高含量阿魏酸木贼提取物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：A、挑选新鲜木贼，先流水冲洗1‑3遍去除杂质、灰尘后，晾干表面水分，经过体积分数60‑80%的乙醇消毒30‑35s，然后用0.1%HgCl2 溶液消毒5‑10min，再用无菌水冲洗5‑8次，放在无菌滤纸上晾干；在无菌条件下用剪刀将木贼切成2‑5mm小段，接种于木贼愈伤组织诱导培养基上进行诱导培养，得到初级培养木贼愈伤组织；将得到的初级培养木贼愈伤组织再转接至木贼愈伤组织诱导培养基进行继代培养两次，得到增殖后的木贼愈伤组织；B、制备高产阿魏酸木贼干细胞培养液：按质量比称取45‑70% MS培养基、10‑25%卡拉胶、2.5‑5.5% 2,4‑二氯苯氧乙酸、1.5‑4.2%蔗糖、0.05‑0.2% 3‑吲哚丁酸、0.05‑0.35% N6‑异戊烯基腺嘌呤、0.04‑0.1%二氢茉莉酮酸甲酯，在玻璃容器中混合加热至75‑82℃，搅拌到完全溶解后冷却到室温，加入适量PBS缓冲液，调节溶液的PH至6.2‑6.7；C、选取步骤A所得的木贼愈伤组织作为种子，按接种量为质量比5%的比例,装入含250mL高产阿魏酸木贼干细胞培养液的500mL培养瓶中悬浮培养，摇床转速控制在100‑120rpm，培养温度控制在25±1℃，光照控制在1000‑1500lx，每天光照8小时，培养10‑12天得到乳白色团簇即木贼干细胞，收获乳白色团簇，用去离子水冲洗干净并冷冻干燥得木贼干细胞固体粉末；D、 按质量比1:（1‑3）将步骤C获得的木贼干细胞固体粉末与丙二醇混合搅拌均匀，使用高压均质机在25000PSI条件下进行破壁匀浆处理；E、 将步骤D获得的细胞破壁匀浆混合物和无水乙醇按质量比1:（2‑3）混合，依次通过10微米聚丙烯过滤器、医用活性炭过滤器、0.45微米聚丙烯过滤膜进行过滤，获得清液在‑10℃冰箱中静置24小时，下层得无色透明柱型结晶，用分液漏斗分出下层柱型结晶，用无水酒精淋洗干净后真空干燥，得高含量阿魏酸木贼提取物。...

【技术特征摘要】
1.一种高含量阿魏酸木贼提取物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：A、挑选新鲜木贼，先流水冲洗1-3遍去除杂质、灰尘后，晾干表面水分，经过体积分数60-80%的乙醇消毒30-35s，然后用0.1%HgCl2溶液消毒5-10min，再用无菌水冲洗5-8次，放在无菌滤纸上晾干；在无菌条件下用剪刀将木贼切成2-5mm小段，接种于木贼愈伤组织诱导培养基上进行诱导培养，得到初级培养木贼愈伤组织；将得到的初级培养木贼愈伤组织再转接至木贼愈伤组织诱导培养基进行继代培养两次，得到增殖后的木贼愈伤组织；B、制备高产阿魏酸木贼干细胞培养液：按质量比称取45-70%MS培养基、10-25%卡拉胶、2.5-5.5%2,4-二氯苯氧乙酸、1.5-4.2%蔗糖、0.05-0.2%3-吲哚丁酸、0.05-0.35%N6-异戊烯基腺嘌呤、0.04-0.1%二氢茉莉酮酸甲酯，在玻璃容器中混合加热至75-82℃，搅拌到完全溶解后冷却到室温，加入适量PBS缓冲液，调节溶液的PH至6.2-6.7；C、选取步骤A所得的木贼愈伤组织作为种子，按接种量为质量比5%的比例,装入含250mL高产阿魏酸木贼干细胞培养液的500mL培养瓶中悬浮培养，摇床转速控制在100-120rpm，培养温度控制在25±1℃，光照控制在1000-1500lx，每天光照8小时，培养10-12天得到乳白色团簇即木贼干细胞，收获乳白色团簇，用去离子水冲洗干净并冷冻干燥得木贼干细胞固体粉末；D、按质量比1:（1-3）将步骤C获得的木贼干细胞固体粉末与丙二醇混合搅拌均匀，使用高压均质机在25000PSI条件下进行破壁匀浆处理；E、将步骤D获得的细胞破壁匀浆混合物和无水乙醇按质量比1:（2-3）混合，依次通过10微米聚丙烯过滤器、医用活性炭过滤器、0.45微米聚丙烯过滤膜进行过滤，获得清液在-10℃冰箱中静置24小时，下层得无色透明柱型结晶，用分液漏斗分出下层柱型结晶，用无水酒精淋洗干净后真空干燥，得高含量阿魏酸木贼提取物。2.根据权利要求1所述的高含量阿魏酸木贼提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤A中木贼愈伤组织诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，并添加蔗糖20-25g...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡喜芬，
申请(专利权)人：佛山文森特知识产权服务有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44